このプロトコルは、分離し腎作用前のヴィヴォ、ミトコンドリアの生体エネルギーを含む評価するためにその後サブ培養することができますマウス主要な腎尿細管細胞を特徴付けるコスト効率の高いアプローチを提供します。
腎尿細管上皮細胞 (TECs) ミトコンドリア機能障害は腎線維症、慢性腎臓病 (CKD) の主な原因につながります。したがって、プライマリ テクスでミトコンドリアの機能を評価する CKD の病態への洞察力を提供する細胞の生体エネルギーの状態に貴重な洞察力あります。分離そして種近位尿細管の浄化のための複雑なプロトコルの数がある、フィールドには尿細管細胞の分離精製を必要とせずに最適コスト効果の高い方法が欠けています。ここでは、両方に焦点を当てて研究マウス近位および遠位腎 TECs を可能に隔離のプロトコルを提供します。コスト効率の高い試薬とこのプロトコルに必要な最小限の動物手順に加え隔離されたセルは分離後高エネルギーのレベルを維持、準連続的な研究を可能にする 4 つの通路まで培養することができます。さらに、高スループット細胞フラックス アナライザーを使用してセル密度と化合物の濃度の最適化に関する推奨事項を提供私たち 96 ウェル プレートで分離のテクスに直接ミトコンドリア呼吸を評価する.これらの観察は、腎 TECs の一貫性のある、よく標準化された生産と腎尿細管ex vivo研究このプロトコルを使用することができることをお勧めします。このプロトコルは、創薬や薬物評価目的のため腎疾患に伴うミトコンドリア機能障害を勉強するより広範な将来のアプリケーションがあります。
腎尿細管上皮細胞 (TEC) 関数は、強く腎臓の全体的な健康状態に関連付けられます。腎線維症と慢性腎臓病 (CKD)1,2で主要な役割を果たしている、TECs の脱分化を引き起こす腎臓の病理組織学的シグナル伝達します。非常に精力的な器官として腎臓、酸素消費量、主にミトコンドリアの酸化的リン酸化3を通じて心に次ぐ。電子顕微鏡を用いた研究は、尿細管4の病理学的イベントにミトコンドリアの形態変化の正の相関関係を明らかにしました。テクスでミトコンドリアの機能不全を引き起こす上皮間葉系に転換5と欠陥のある脂肪酸酸化6腎線維化。線維症は、CKD の進行性腎病理です。CKD の病態生理を明らかにする必要がしたがって、腎 TECs のエネルギッシュな状態を理解することです。
大人腎臓7で > 20 種類の細胞があります。TECs の機能を研究、化学治療や遺伝子操作などの分子生物学のアプリケーションのためのプラットフォームとして腎上皮細胞の初代培養が必要です。重要な生体内で遺伝子を介して、または分離の主細胞と遺伝子操作すでに AAV 遺伝子配信テクニック8を使用してマウスの遺伝的操作を行うことができます。人間17、ウサギ15,16, イヌ14ラット11,12,13マウス9,10から主な腎尿細管細胞の分離 ,18は、純粋な近位尿細管細胞を生成する精製ステップで報告されています。近位尿細管細胞の分離に焦点を当てるこれらの以前に発行されたプロトコル浄化目的19勾配遠心法と並べ替えの実験を行った。これらのプロトコルは、近位尿細管を勉強するために貴重な彼らは近位および遠位尿細管が調査されるべき必要な場合十分なありません。たとえば、近位および遠位尿細管疾患進行20で重要な役割を再生し、文化で尿細管の両方の種類を調べる必要があるため、アルポート症候群に関する我々 の研究が明らかにしました。腎のフッ化物の毒性に関する最近の研究はまた、近位および遠位尿細管21の病理学的変化が起こったことを示した。したがって、この隔離のプロトコルを設計して、試薬および簡単な手順の最小限のコストでのマウスの腎臓の近位および遠位尿細管細胞の最適化します。また、捜査官がステップ 3.1 までプロトコルに従ってまだ、しこれ以降純粋な近位尿細管細胞の分離精製手順9を追加できます。
隔離されたセルは高エネルギー レベルを示し 4 通路にサブカルチャー後腎上皮特性を維持します。ハイスループット細胞フラックス アナライザーを使用して直接セル密度最適化に関するさらなる知見につながる 96 ウェル プレートで分離 TECs ミトコンドリア呼吸を評価します。腎尿細管ex vivo研究腎 TECs の一貫性のある、よく標準化された生産をこのプロトコルを適用できることが示唆されました。このプロトコルの追加された意義は近位および遠位尿細管細胞のミトコンドリアのエネルギー代謝の前のヴィヴォ特性評価のための高スループット ツールとして可能な使用法です。したがって、創または腎疾患の薬剤評価の目的のためのプラットフォームとして利用することができます。
マウス腎尿細管上皮細胞 (TECs) の効率的な分離を可能にするプロトコルを最適化し、, セルが存在下における脂肪酸のミトコンドリアの呼吸を評価する細胞外フラックス解析のためサブ培養することができます。および/またはブドウ糖ベース基板。このプロトコルは近位および遠位尿細管細胞に着目した研究のため、テック病理学関連の腎疾患の理解のためのより複雑な実験を構築するフレームワークとして提供しています。以前に公開されたプロトコル9,10,19に比べると、このメソッドの並べ替えに勾配分離遠心時間が長くまたは十分な抗体の使用量を必要としない、したがってよりを提供しています腎尿細管代謝分野で働く研究者のための効率的かつ最適化されたガイド。このプロトコルは、消化、再収集とメッキ密度細胞フラックスの試金のための化合物の最適化などでいくつかの重要な手順があります。
腎組織から成功した消化力および尿細管細胞の解離をキーは、コラゲナーゼと最適濃度の正しい種類を選択します。2 型コラゲナーゼにはコラーゲンの他のタイプと比較して、プロテアーゼ活性、コンパクトな腎の構造を分離することができるの比較的高いレベルが含まれています。、長時間血流と消化時間の結果、汚染の可能性を最小限に抑える 0.013 %2 型コラゲナーゼは 30 mL/分で灌流。腎被膜は、両方の腎臓を動物から収穫し、滅菌細胞文化フードに転送後にのみ削除されました。腎臓は、小さな断片にみじん切りしたし、完全な消化力と尿細管細胞の最大のリリースのための別の 5 分消化バッファーによる 10 mL の培養を続けた。
消化後組織懸濁液は、非常に大規模な組織の部分を削除する 70 μ m フィルターを通過は、されますが、未消化の尿細管はフィルターを通過し、細胞懸濁液内にとどまる、培養皿の上にメッキを得る。これらの尿細管尿細管細胞を解放し、培養皿をしっかりと付けるのため通常よりも長い時間がかかります。したがって、むしろ細胞懸濁液を収集し、遠心分離機のペレット未接続尿細管及びセル セルめっき後 2 日目にすることが重要です。この低速遠心分離のステップは、さらに尿細管細胞よりも軽量化は、他の細胞型を削除し、未接続の尿細管と尿細管細胞を解決することができます。
適切な細胞密度の識別は、正常細胞フラックスの試金のためのキー最初のステップです。XF96 マイクロ プレートのウェルあたり 40,000 の細胞は脂肪酸やグルコースを用いた呼吸法 (図 3) のプライマリ尿細管細胞の理想的な結果を示した。このプロトコル分離尿細管細胞は、1 と 2 の通路で細胞外のフラックスの試金のために使用されていました。サブ鋼管マーカー (図 2) と生体エネルギーの試金 (図 3 a) でまともな性能の表現を維持し、通路 2 と比較して減少した基底呼吸レベルを示した 3 を通過する培養細胞(図 3図 3 aの右端のパネルで OCR を比較することによって示されている)。この減少は可能性があります (たとえば、若い野生型マウスから分離したもの) 実質的に健康的な尿細管の細胞には影響を与えません。ただし、既に減少ミトコンドリア呼吸を持っている CKD マウス モデルから分離された細胞の研究、細胞の高い通路は基底の呼吸細胞フラックス アッセイの結果に影響を与えるのさらなる減少あります。研究はここでは、実施 1 の通路通路 2 高を示した基底呼吸レベルから細胞。したがって、このプロトコルに従って、これらの 2 つの初期の通路を用いた健康と病気動物から分離した細胞ミトコンドリア呼吸研究することをお勧めします。通路 1 サブカルチャーにフラックスの試金のための十分な細胞が得られない場合、2 の通路からセルを考慮取らまだべきであります。生体エネルギーの研究に加えて私たちの以前の研究は、通路 3 プライマリ TECs を化合物のタンパク質と RNA 研究 (データは示されていない) が続くと治療に非常に有用することができますを示しています。つまり、私達は調査官の尿細管細胞を分離するこのプロトコルを使用するが異なる研究用途に最適な通路を慎重に選択する必要があります提案します。
細胞外フラックス解析の動作原理は、ランプの効果と呼吸鎖複合体注入の化合物間の相互作用に基づいています。オリゴマイシンは複雑な V (ATP 合成酵素) の抑制剤である、ATP リンク酸素消費量およびミトコンドリア内膜32間で正規のプロトン漏れを克服するために必要な酸素消費量を区別するために使用されます。FCCP ミトコンドリア膜電位を混乱させることによって ATP の生産から酸素消費量の情報から切り離します。したがって、それは、膜を介したプロトン輸送を許可することで ATP 合成酵素によるプロトン イオン流出の限られた容量を回避最大呼吸能力の測定を提供します。アンチマイシン A 複雑な III の阻害剤とロテノン、複雑な私のブロッカー、非ミトコンドリアの酸素消費量、ミトコンドリアとの区別をできるように全体のミトコンドリア呼吸をシャット ダウンする組み合わせで使用されてセルをします。これらの化合物は、細胞外のフラックス測定前に最適な OCR 曲線をもたらす最適な濃度を決定する特定のセルタイプの常に滴定する必要があります。ここでは、1 μ M のオリゴマイシン、FCCP の 1 μ M、ロテノン/アンチマイシン A プライマリ TECs の細胞フラックスの試金のための 2 μ M をお勧めします。
結論としては、このプロトコルは、腎主近位および遠位尿細管上皮細胞前のヴィヴォミトコンドリアの生体エネルギーを評価するために使用できるを分離する簡単かつコスト効果の高い方法を提供します。このプロトコルは、腎尿細管上皮細胞の生物機能の探索分子生物学の広い範囲で役に立ちますが、純粋な近位または遠位尿細管を必要とする研究に適用するとき我々 はその限界を認めます。たとえば、Lowe 症候群、選択的近位尿細管機能障害33、または遠位腎尿細管性アシドーシス、遠位尿細管機能障害34, に関する研究に関する研究が細胞分離のより高度なプロトコルを必要と浄化。ただし、糸球体と尿細管を比較研究の大半および一般に尿細管細胞の潜在的なミトコンドリア呼吸レギュレータを選別する研究では、プロトコルは高いスループットを実現可能なアプローチを提供します。したがって、このプロトコルには、検出またはターゲット検証目的で薬腎疾患に伴うミトコンドリア機能障害を研究する広範なアプリケーションがあります。
The authors have nothing to disclose.
この作品はリナ shehadeh A.-投稿日時に対する次の補助金によって支えられた: 国立衛生研究所の (R56HL132209 および 1R01HL140468) およびマイアミの心研究所。
Collagen I Rat Protein, Tail | ThermoFisher Scientific | A1048301 | |
Acetic Acid | J.T.Baker | 9508 | |
Collagenase Type II | Worthington | LS004176 | |
PBS | Sigma | D8537 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
Renal Epithelial Cell Growth Medium 2 Kit | PromoCell | C-26130 | |
2-Deoxy glucose | Sigma | D6134 | |
Glucose | Sigma | G8270 | |
L-Carnitine | Sigma | C0283 | |
Etomoxir | Sigma | E-1905 | |
Oligomycin | Sigma | 75351 | |
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | |
Rotenone | Sigma | R8875 | |
Antimycin-A | Sigma | A8674 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
Sodium palmitate | Sigma | P9767 | |
NaCl | Sigma | S7653 | |
Sodium pyruvate | Sigma | P5280 | |
L-Glutamine 200mM solution | Sigma | G7513 | |
DMEM powder | Sigma | D5030-1L | |
Hoechst 33342 | LifeTechnologies | H3570 | |
Trypan Blue Staining (0.4%) | LifeTechnologies | T10282 | |
Counting Slides | Bio-Rad | 145-0011 | |
Micro Dissecting Forceps | Roboz | RS-5101 | |
TC10 automated cell counter | Bio-Rad | 506BR2119 | |
MINIPULS 3 Peristaltic Pump | Gilson Inc. | GM3P | |
Seahorse XFe96 Analyzer | Seahorse Bioscience | S7800A | |
Seahorse XFe96 FluxPack (includes sensor cartridges, microplates, and calibrant) | Seahorse Bioscience | 10260-100 |