Лентивирусные опосредованной производства трансгенных мышей: простой и очень эффективный метод для непосредственного изучения учредителей

Новаторскую работу Гордон et al. в 1980 году показал, что после имплантации в pseudopregnant мышей, плазмида ДНК инъекции в мужской pronuclei оплодотворенных яйцеклеток может принести производства трансгенных животных, которые интегрированы плазмида ДНК¹. Демонстрация, что могут быть получены трансгенные млекопитающих оказали огромное воздействие на глобальные наук о жизни, открыв путь к Роман областях исследований, как для фундаментальных наук и трансляционная биомедицинских наук. В последние четыре десятилетия ДНК микроинъекции стало обычной практикой. Хотя огромное количество трансгенных мышей были произведены, стандартный метод не является полностью пригоден для всех штаммов мыши и требует много времени беккроссов^2,3. Его применение в отношении других видов остается сложной⁴ и урожайность трансген интеграции ограничивается несколько процент род животных⁵. Кроме того эффективность интеграции трансген представляет сдерживающим фактором, который объясняет бедных урожайность pronuclear ДНК инъекции. В этой связи интегративной вирусных векторов являются наиболее эффективные инструменты для груза и интегрировать трансгенов и таким образом может предоставить новые средства для значительного увеличения урожайности интеграции, единственное ограничение в том, что размер трансген, который не может превышать 10 КБ⁶ .

Лентивирусные векторы псевдо-типизированных с конверт белков вируса везикулярного стоматита (ВСВ) являются инструментами передачи pantropic и высоко интегративной гена и может использоваться для передают оплодотворенных яйцеклеток⁷. Zona pellucida окружающих яйцеклеток является естественным вирус барьер и должен быть передан позволить трансдукция с лентивирусные векторы. Трансгенные животные были получены путем преобразования оплодотворенных яйцеклеток после микро бурение или удаление вителлинового^8,9. Однако инъекции под вителлинового в пространстве наблюдаться, по-видимому, самый простой способ передавать оплодотворенные яйца как первоначально описано Лоис и коллеги-⁷.

Наблюдаться инъекции лентивирусные векторы позволяет высокие урожаи в производстве трансгенных животных, которые находятся выше 70% род животных. Такая доходность свыше 10 раз выше, чем лучший доходность, которая может быть достигнута с помощью стандартных pronuclei ДНК инъекций^7,10,11. В этом контексте одной сессии инъекции создаст по меньшей мере 50 основатели трансгенное (F0). Таким образом, большое количество учредителей совместим с фенотипирование эффекта трансген, непосредственно над F0 мышей без необходимости создания трансгенные мыши линии. Это преимущество позволяет для быстрого скрининга трансген эффект и специально приспособлены для выполнения в vivo выгоды и потери функции исследований в течение недели. Кроме того регулирующие элементы ДНК можно также быстро проверяться на карте усилители и ДНК мотивы связаны факторы транскрипции^11,12. С pronuclear инъекции трансгенов обычно интегрировать как несколько копий в уникальный Локус. С лентивирусные векторы интеграция происходит в нескольких локусов одну копию за Локус^10,13. Таким образом множество интегрированных локусов скорее связаны с очень высокой выражение пенетрантностью, наблюдается в трансгенных учредителей, что делает новый сгенерированной модели более надежной.

Важно отметить, что при использовании pronuclear для инъекций ДНК, визуализация pronuclei во время процедуры абсолютно необходим. Это техническое ограничение предотвращает использование оплодотворенных яйцеклеток, происходящих из разнообразных штаммов мыши. Таким образом, производство трансгенных модели в определенном напрягаться, для которых pronuclei невидимый требует производства животных в разрешительной штамм следуют по крайней мере 10 последовательных беккроссов для передачи трансген в желаемой мыши штамм. С лентивирусные вектор инъекции наблюдаться пространства всегда видна и инъекции не требует узкоспециализированных навыков. В качестве примера NOD/SCID трансгенных мышей, которые не подходят для инъекций pronuclei были получены с вирусный вектор инъекции¹⁴.

Здесь всеобъемлющий протокол представляется простой производства трансгенных мышей с использованием инъекций лентивирусные вектора в пространстве наблюдаться одной ячейки стадии эмбриона. Трансген выражение, контролируемых либо с вездесущими или подробно описаны конкретные промоутеров ячейки.

PTrip ΔU3 лентивирусные костяк был использован в данном исследовании¹⁵. Этот вектор позволяет производить репликацию дефектных лентивирусные векторы, в которых последовательность U3 был частично удален чтобы удалить U3 промоутер активности и создания самостоятельной инактивирующего вектор (SIN)¹⁶. Лентивирусные вектор запасы были произведены переходных transfection клеток ГЭС 293T с p8.91 инкапсуляции плазмида (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)⁶, pHCMV-G кодирование гликопротеин G (ВСВ) вирус везикулярного стоматита¹⁷и pTRIP ΔU3 Рекомбинатные вектор. Процедура подробно производства предоставляется в качестве дополнительных методов.

Производство высокого титра лентивирусные вектор запасов осуществляется в условиях биобезопасности уровня II (BSL-2). Это верно для большинства трансгенов за исключением онкогенов, которые должны быть произведены в BSL-3. Таким образом производство в условиях BSL-2 в большинстве случаев достаточно. Кроме того использование и производство обычно отключены для большинства национальных регулирующих органов, занимающихся генетически модифицированных организмов (ГМО). Ограниченное количество некомпетентных ГРЕХ репликации лентивирусные векторы (ниже 2 мкг белка капсид p24) может использоваться в условиях BSL-1, как описано в ГИО французского Агентства согласился с рекомендациями Европейского союза.