Lentivirales mediación producción de ratones transgénicos: un método Simple y altamente eficiente para el estudio directo de los fundadores

El trabajo pionero de Gordon et al. en 1980 demostró que después de la implantación en ratones seudopreñadas, la inyección de DNA de plásmido en la masculina pronúcleos de ovocitos fertilizados puede rendir la producción de animales transgénicos que integran el plásmido de ADN¹. La demostración que mamíferos transgénicos pueden ser generados tuvo un enorme impacto en Ciencias de la vida mundiales, abriendo el camino a nuevos campos de investigación tanto en ciencias básicas y ciencias biomédicas traslacionales. En las últimas cuatro décadas, microinyección de ADN se ha convertido en una práctica habitual. Aunque se han producido un número enorme de ratones transgénicos, el método estándar no es plenamente utilizable para todas las cepas de ratón y requiere mucho tiempo retrocruzamientos^2,3. Su aplicación a otras especies sigue siendo un reto⁴ y el rendimiento general de integración del transgén se limita a unos porcentaje de animales nacidos⁵. Además, la eficacia de la integración del transgen representa el factor limitante que explica el pobre rendimiento general de la inyección de ADN pronuclear. En este sentido, integrantes vectores virales son las más eficientes herramientas para carga e integran los transgenes y así podrían proporcionar nuevos medios para incrementar significativamente el rendimiento de la integración, la única limitación es que el tamaño del transgén que no puede superar los 10 kb⁶ .

Vectores lentivirales pseudo-mecanografiados con la proteína de la envoltura de los Virus de la Estomatitis Vesicular (VSV) son herramientas de transferencia de gen pantropic y altamente integrador y pueden utilizarse para transducir ovocitos fertilizados⁷. La zona pelúcida que rodea los ovocitos es una barrera natural virus y necesita ser pasado para permitir la transducción de los vectores lentivirales. Animales transgénicos han sido generados por transductoras ovocitos fertilizados después de micro perforación o extracción de la zona pelúcida^8,9. Sin embargo, la inyección debajo de la zona pelúcida en el espacio perivitelino parece ser el método más simple para transducir los huevos fecundados como descrito inicialmente por Lois y colegas⁷.

La inyección de perivitelino de vectores lentivirales permite altos rendimientos en la producción de animales transgénicos que están sobre el 70% de los animales nacidos. Tal producción es más de 10 veces superior a la mejor producción que puede lograrse utilizando estándar pronúcleos ADN inyección^7,10,11. En este contexto, una sola sesión de inyecciones generará a por lo menos 50 fundadores transgénicos (F0). Por lo tanto, el gran número de fundadores es compatible con fenotipo del transgen efecto directamente realizado sobre ratones F0 sin la necesidad de generar líneas de ratón transgénico. Esta ventaja permite la rápida detección de los efectos del transgen y está adaptada para realizar en vivo la ganancia y la pérdida de estudios de la función dentro de las semanas. Además, elementos reguladores del ADN pueden también rápidamente proyectará para asignar potenciadores y motivos de ADN por transcripción factores^11,12. Con inyección pronuclear, los transgenes generalmente integrar copias múltiples en un único locus. Con vectores lentivirales, integración ocurre en loci múltiples como una sola copia por locus^10,13. Por lo tanto, la multiplicidad de loci integrados es probablemente asociado a la penetrancia muy alta expresión observada en los transgénicos fundadores, que hace el nuevo modelo generando más robusto.

Lo importante, al utilizar inyección pronuclear de DNA, visualización de los pronúcleos durante el procedimiento es absolutamente necesario. Esta limitación técnica evita el uso de ovocitos fertilizados procedentes de una gran variedad de cepas de ratón. Por lo tanto, la producción de un modelo transgénico en un específico de la cepa para que pronúcleos son invisibles requiere la producción de animales en una cepa permisiva seguido por al menos 10 sucesivas retrocruzas para transferir el transgen en el ratón deseado cepa. Con las inyecciones de vectores lentivirales, espacio perivitelino siempre está visible y la inyección no requiere de habilidades muy específicas. Por ejemplo, se han obtenido ratones transgénicos NOD/SCID que no son apropiados para la inyección de pronúcleos con los vectores virales inyecciones¹⁴.

Aquí, se presenta un protocolo integral para permitir la simple producción de ratones transgénicos usando inyecciones lentivirales vector en el espacio perivitelino de un embrión de la etapa de una célula. Expresión del transgén controlada ya sea con ubicua o promotores específicos de la célula se describe en detalle.

El backbone lentivirales pTrip ΔU3 fue utilizado en este estudio¹⁵. Este vector permite la producción de vectores lentivirales defectuoso de replicación en la que la secuencia de U3 se ha eliminado parcialmente para eliminar la actividad de promotor de U3 y generar una uno mismo-inactivador de vector (pecado)¹⁶. Las poblaciones de vectores lentivirales fueron producidas por transitorios de la transfección de células HEK-293T con el p8.91 encapsulación plásmido (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)⁶, pHCMV-G codificación de la estomatitis vesicular (VSV) virus de la glicoproteína G¹⁷y el ΔU3 pTRIP vector recombinante. El procedimiento de producción detallada se proporciona como métodos suplementarios.

Producción de las poblaciones de vectores lentivirales de alto título se realiza en condiciones de nivel II de bioseguridad (BSL-2). Esto es cierto para la mayoría de los transgenes excepto oncogenes que tienen que ser producido en el BSL-3. Por lo tanto, la producción en condiciones BSL-2 para la mayoría de los casos es suficiente. Además, el uso y la producción generalmente se desconectan para la mayoría las agencias reguladoras nacionales con organismos modificados genéticamente (OMG). Cantidades limitadas de vectores lentivirales incompetentes de pecado la replicación (por debajo de 2 μg de la proteína de cápside p24) pueden utilizarse en condiciones BSL-1 según lo descrito por la agencia francesa OGM de acuerdo con las recomendaciones de la Unión Europea.