Aislamiento de los ganglios de raíz dorsal y en cultivo primario para el estudio de liberación de neurotransmisor
Summary
Cultivos primarios de raíz dorsal (GRD) de los ganglios se utilizan con frecuencia para estudiar las funciones fisiológicas o eventos relacionados con patología en las neuronas sensoriales. Aquí, se demuestra el uso de culturas DRG lumbares para detectar la liberación de neurotransmisores después de receptor del neuropéptido FF tipo 2 estimulación con un agonista selectivo.
Abstract
Ganglios de raíz dorsal (GRD) contienen cuerpos celulares de neuronas sensoriales. Este tipo de neurona es pseudo-unipolar, con dos axones que inervan los tejidos periféricos, tales como piel, músculo y órganos viscerales, así como el cuerno dorsal espinal del sistema nervioso central. Las neuronas sensoriales transmiten sensación somática, como tacto, dolor, sensaciones térmicas y propioceptivas. Por lo tanto, cultivos primarios DRG son ampliamente utilizados para estudiar los mecanismos celulares del nociception, funciones fisiológicas de las neuronas sensoriales y desarrollo neuronal. Las neuronas cultivadas pueden aplicarse en estudios de electrofisiología, transduction de la señal, liberación de neurotransmisor o proyección de imagen de calcio. Con cultivos primarios de DRG, los científicos pueden cultura disociada las neuronas DRG para monitorear los cambios bioquímicos en solo o varias celdas, superando muchas de las limitaciones asociadas con experimentos en vivo . En comparación con comercialmente disponibles líneas celulares de hibridoma DRG o inmortalizadas las líneas de células neuronales de DRG, la composición y propiedades de las células primarias son mucho más similares a las neuronas sensoriales en el tejido. Sin embargo, debido al limitado número de DRG primaria las células cultivadas que pueden ser aislados de un solo animal, es difícil realizar pantallas de alto rendimiento de drogas dirigidas a estudios. En el actual artículo, se describen los procedimientos para la colección de DRG y la cultura. Además, demostramos que el tratamiento de células cultivadas de DRG con un agonista del receptor del neuropéptido FF tipo 2 (NPFFR2) para inducir la liberación de neurotransmisores péptido (péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CRGP) y sustancia P (SP)).
Introduction
Los cuerpos celulares de las neuronas sensoriales están contenidos dentro de DRG. Estas neuronas son pseudo-unipolares e inervan los tejidos periféricos y el sistema nervioso central. Las terminaciones nerviosas periféricas de las neuronas sensoriales se encuentran en el músculo, piel, órganos viscerales y óseas, entre otros tejidos. Transmiten las señales de sensación periférica nervio conclusiones en el cuerno dorsal espinal y las señales se transmiten luego al cerebro a través de diferentes vías ascendentes de la sensibilidad somática1,2. Sensación somática permite al cuerpo a sentir (es decir, tacto, dolor y sensaciones térmicas) y percibir el movimiento y orientación espacial (sensaciones propioceptivas)1,3. Hay cuatro subclases de axones aferentes primarios, incluyendo el grupo I (Aα) fibras que responden a la propiocepción de los músculos esqueléticos, fibras de II (Aβ) grupo que responden a los mecanorreceptores de la piel, y grupo III (Aδ) y fibras de V (C) grupo que responden al dolor y temperatura. Sólo las fibras C son amielínicas, mientras que el resto son myelinated en diferentes grados.
Nociceptores son las neuronas sensoriales primarias, que son activadas por estímulos nocivos (estímulo mecánico, térmico y químico) que llevan la posibilidad de daño tisular. Estas neuronas están compuestos por fibras Aδ myelinated y unmyelinated fibras de C1,4. Las fibras Aδ expresan los receptores para el factor de crecimiento nervioso (NGF, trkA receptor), CGRP y SP. Las fibras C se clasifican como fibras C o peptidérgicos y no peptidérgicos. Por otra parte, las fibras de C peptidérgicos no expresan los receptores para el factor neurotrophic glial-derivado (GDNF, RET y GFR receptores), proteína IB4 y ATP-gated ion canal subtipo (P2X3)5,6,7. Nociceptores pueden ser distinguidos por la expresión de canales iónicos y activados por factores neurotróficos, citoquinas, neuropéptidos, ATP u otro producto químico compuestos de8. Sobre el estímulo, se pueden liberar neurotransmisores, como glutamato, CGRP y SP de los terminales de la neurona sensorial en el cuerno dorsal espinal para transmitir las señales nociceptivas2. DRG no sólo están compuesta de neuronas, pero también contienen células glial satélite. Las células satélites rodean las neuronas sensoriales y proporcionar soporte mecánico y metabólico9,10. Curiosamente, hay un creciente cuerpo de evidencia que indica que las células glial satélite en el DRG podrían estar implicadas en la regulación de la sensación de dolor11.
Las neuronas sensoriales se han divulgado más con frecuencia utilizan las células neuronales primarias12 y se han utilizado para estudios de liberación de neurotransmisor, electrofisiología y transducción de la señal. Comúnmente se utilizan para explorar los mecanismos celulares del desarrollo neuronal, dolor inflamatorio, dolor neuropático, sensación de la piel (como pica) y axón resultado12,13,14,15. Cultivos primarios de DRG pueden cultivarse como neuronas disociadas para evaluar los cambios bioquímicos en uno o varias celdas, permitiendo a los científicos realizar estudios que no se puede realizar en sujetos experimentales. Recientemente, DRG fueron cultivadas con éxito de los donantes de órganos humanos que podrían beneficiarse enormemente la investigación traslacional16. Por otra parte, las neuronas sensoriales pueden cultivarse también como explantes de DRG. Los explantes DRG preservar la arquitectura original del tejido de las neuronas, incluyendo las células de Schwann y células gliales por satélite y son especialmente útiles para estudiar las interacciones entre las células neuronales y no neuronales17. Cultivos primarios DRG pueden prepararse fácilmente en 2,5 horas. Las propiedades y composición de la célula son altamente reflectantes de la fuente DRG, y como tal, GRD específico (DRG lumbar o torácica) se recogerán según demandas experimentales. Cultivos de neuronas DRG embrionarias y neonatales requieren NGF sobrevivir e inducir consecuencia de axon, pero cultivos de neuronas adultas no requieren la adición de factores neurotróficos a los medios de comunicación12,17. También hay disponibles comercialmente líneas celulares de hibridoma DRG como ND7/23 y F11, que no requieren el uso de animales de experimentación. Sin embargo, la falta de la cación potencial transitorio del receptor canal de miembros de la subfamilia V 1 (TRPV1) expresión (un marcador importante para pequeñas sensoriales neuronas nociceptivas) y perfiles de expresión génica incongruente limitan sus aplicaciones18. Recientemente, inmortalizado células neuronales DRG líneas han sido derivadas de rata (50B11)19 y20de ratón (MED17.11), que son convenientes para usan en pantallas de alto rendimiento de drogas dirigidas a estudios. Sin embargo, la expresión génica perfiles para estas líneas celulares aún no ha realizarse. Así, los experimentos de validación comparando estas células inmortalizadas en las neuronas sensoriales están aún en curso.
NPFFR2 es sintetizado en el DRG y trasladadas a las terminales nerviosas sensoriales en el cuerno dorsal espinal21. En este artículo, proporcionamos un protocolo para el cultivo de células DRG lumbares y tratamiento con un agonista de los NPFFR2 para inducir la liberación de neurotransmisores, CGRP y SP. La dependencia de NPFFR2 más se prueba usando NPFFR2 pequeña interferencia RNA (siRNA), que puede transfected en las células cultivadas de la DRG.
Protocol
Representative Results
Discussion
En el presente artículo, nos muestran la colección, disociación de la enzima y la cultura de lumbar de la rata DRG. Con el apoyo de neurotróficos de NGF, los axones de las neuronas DRG extendido dentro de 3 días después de la siembra de células. Los axones extendidos fueron claramente observables después de que las células se tiñeron para proteína CGRP, que es sintetizada en el soma celular y transportada a lo largo de las fibras de axones. Los procesos de células satélite también extendidos, permitiendo qu…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Dr. M. Calkins para la edición de inglés. Este trabajo fue apoyado por el Chang Gung Memorial Hospital (CMRPD1F0482), Chang Gung University, centro de investigación de envejecimiento saludable (EMRPD1G0171) y Ministerio de ciencia y tecnología (105-2320-B-182-012-MY2).
Materials
| Mixture of tiletamine and zolazepam (Zoletil) | Virbac | Zoletil 50 | anaesthetic |
| Fetal bovine serum | Biological Industries | 04-001-1 | Culture Medium |
| sodium pyruvate | Sigma | S8636 | Culture Medium |
| penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-033-1 | Culture Medium |
| DMEM-F12 | Invitrogen | 12400024 | Culture Medium |
| Poly-l-lysine | Sigma | P9011 | Coating dish |
| Collagenase IA | Sigma | 9001-12-1 | Enzyme digestion |
| Hank's balanced salt solution | Invitrogen | 14170-112 | Culture Medium |
| Trypsin EDTA | Biological Industries | 03-051-5 | Enzyme digestion |
| Pasteur pipette | Hilgenberg | 3150102 | Cell trituration |
| Cytarabine (Ara-C) | Sigma | C6645 | Culture Medium |
| NGF | Millipore | NC011 | Culture Medium |
| NPFFR2 siRNA | Dharmacon | L-099691-02-0005 | Transfection |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | L-001810-10-05 | Transfection |
| NeuroPORTER Reagent | Genlantis | T400150 | Transfection reagent |
| dNPA | Genemed Synthesis | N/A | NPFFR2 agonist |
| CGRP ELISA | Cayman | 589001 | EIA |
| SP ELISA | Cayman | 583751 | EIA |
| CGRP antibody | Calbiochem | PC205L | IHC |
| DAPI | Roche | 10236276001 | IHC |
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