Isolamento de gânglios das raízes dorsais e cultura primária para estudar a liberação de neurotransmissores
Summary
Culturas primárias do (DRG) os gânglios das raízes dorsais são frequentemente usadas para estudar as funções fisiológicas ou eventos relacionados à patologia em neurônios sensoriais. Aqui, vamos mostrar o uso de culturas DRG lombares para detectar a liberação de neurotransmissores, depois neuropeptídio FF receptor tipo 2 estimulação com um agonista seletivo.
Abstract
Gânglios da raiz dorsal (DRG) contêm os corpos celulares dos neurônios sensoriais. Este tipo de neurônio é pseudo unipolar, com dois axônios que inervam tecidos periféricos, tais como pele, músculos e órgãos viscerais, bem como o corno dorsal da coluna vertebral do sistema nervoso central. Neurônios sensoriais transmitem sensação somática, incluindo dor, toque, sensações térmicas e proprioceptivas. Portanto, culturas primárias de DRG são amplamente utilizadas para estudar os mecanismos celulares de nocicepção, funções fisiológicas de neurônios sensoriais e desenvolvimento neural. Os neurônios cultivados podem ser aplicados em estudos envolvendo a eletrofisiologia, transdução de sinal, liberação de neurotransmissores ou imagem de cálcio. Com culturas primárias de DRG, os cientistas podem cultura dissociada DRG neurônios para monitorar as alterações bioquímicas no single ou várias células, superando muitas das limitações associadas com experiências na vivo . Em comparação com comercialmente disponíveis linhas de células de hibridoma-DRG ou imortalizado DRG célula neuronal linhas, da composição e propriedades das células primárias são muito mais semelhantes a neurônios sensoriais no tecido. No entanto, devido ao número limitado de culturas de células primárias DRG que pode ser isolado de um único animal, é difícil de executar telas de alto rendimento para drogas como alvo de estudos. No artigo atual, são descritos os procedimentos para a recolha de DRG e cultura. Além disso, vamos demonstrar o tratamento de pilhas cultivadas DRG com um agonista do neuropeptídio FF do receptor tipo 2 (NPFFR2) para induzir a liberação de neurotransmissores de peptídeo ((CRGP) peptídeo relacionados ao gene da calcitonina e substância P (SP)).
Introduction
Os corpos celulares dos neurônios sensoriais estão contidos DRG. Estes neurônios são pseudo unipolares e inervam tanto tecidos periféricos e sistema nervoso central. As terminações de nervos periféricos de neurônios sensoriais encontram-se em músculo, pele, órgãos viscerais e osso, entre outros tecidos. Eles transmitem sinais periféricos sensação nervo terminações no Corno dorsal da coluna vertebral e os sinais são então transmitidas para o cérebro através de diferentes percursos ascendentes da sensação somática1,2. Sensação somática permite o corpo a sentir (ou seja, toque, dor e sensações térmicas) e perceber o movimento e orientação espacial (sensações proprioceptivas)1,3. Existem quatro subclasses de axônios aferentes primários, incluindo grupo I fibras (Aα) que respondem a propriocepção dos músculos esqueléticos, fibras de grupo II (Aβ) que respondem a mecanorreceptores da pele, e grupo III (Aδ) e fibras de V (C) do grupo que respondem à dor e temperatura. Somente as fibras C são amielínicas, enquanto o resto são mielinizadas de diferentes graus.
Os nociceptores são neurônios sensoriais primários, que são ativados por estímulos nocivos (estimulação mecânica, térmica e química) que carregam o potencial de dano tecidual. Estes neurônios são compostos de fibras mielinizadas de Aδ e amielínicas C fibras1,4. As fibras Aδ expressam os receptores para fator de crescimento do nervo (NGF, trkA receptor), CGRP e SP. As fibras C são classificadas como peptidérgicos ou não-peptidérgicos fibras C. Por outro lado, fibras C não-peptidérgicos expressam os receptores para fator neurotrófico derivado de glia (GDNF, RET e GFR receptores), isolectin IB4 e iônicos ATP canal subtipo (P2X3)5,6,7. Os nociceptores podem ser distinguidos pela expressão de canais iônicos e ativados por fatores neurotróficos, citocinas, neuropeptídeos, ATP ou outros químicos, compostos de8. Estimulação, neurotransmissores, incluindo CGRP, SP e glutamato podem ser liberados da terminais do neurônio sensorial no Corno dorsal da coluna vertebral para transmitir sinais nociceptivos2. DRG não são apenas composto de neurônios, mas também contêm células gliais do satélite. Células satélites envolvem os neurônios sensoriais e fornecer apoio mecânico e metabólica9,10. Curiosamente, há um crescente corpo de evidências que indicam que células gliais satélite em DRG podem estar envolvidas na regulação da dor sensação11.
Neurônios sensoriais foram relatados para ser o mais frequentemente usado células neuronais primários12 e têm sido utilizado para estudos de liberação do neurotransmissor, transdução de sinal e Eletrofisiologia. Eles também são comumente usados para explorar os mecanismos celulares de desenvolvimento neuronal dor inflamatória, dor neuropática, sensação de pele (como coceira) e axônio consequência12,13,14,15. Culturas primárias de DRG podem ser cultivadas como neurônios dissociados para avaliar as alterações bioquímicas em uma ou várias células, permitindo que os cientistas realizar estudos que não podem ser executados em disciplinas experimentais. Recentemente, o DRG foram cultivadas com sucesso de doadores de órgãos humanos que podem beneficiar muito a pesquisa translacional16. Por outro lado, os neurônios sensoriais também podem ser cultivados como DRG explants. Os explantes DRG preservar a arquitetura original do tecido dos neurônios, incluindo células de Schwann e células gliais do satélite e são especialmente úteis para estudar as interações entre as células neuronais e não-neuronal17. Culturas primárias de DRG podem ser facilmente preparadas dentro de 2,5 h. A composição celular e propriedades são altamente reflexivas da fonte DRG, e como tal, DRG específico (DRG lombar ou torácica) pode ser recolhido de acordo com demandas experimentais. Culturas de neurônios DRG embrionários e Neonatais requerem NGF sobreviver e induzir a consequência natural do axônio, mas culturas de neurônios adultos não necessitam da adição de fatores neurotróficos para a mídia12,17. Existem também linhas de células de hibridoma-DRG comercialmente disponíveis como ND7/23 e F11, que não exigem o uso de animais experimentais. No entanto, a falta de cátion potencial transiente do receptor canal membro da subfamília V 1 (TRPV1) expressão (um importante marcador para pequenos neurônios nociceptivos sensoriais) e perfis de expressão de gene incongruentes limitam seus aplicativos18. Recentemente, imortalizada célula neuronal DRG linhas foram derivadas de rato (50B11)19 e rato (MED17.11)20, que são apropriados para usam em telas de alta produtividade para drogas como alvo de estudos. No entanto, a expressão gênica profiling para estas linhas de célula ainda tem de ser realizada. Assim, os experimentos de validação comparando estas células imortalizadas de neurônios sensoriais ainda estão em andamento.
NPFFR2 é sintetizado em DRG e translocados para os terminais de nervo sensorial no Corno dorsal da coluna vertebral21. Neste artigo, nós fornecemos um protocolo para cultivo de células DRG lombares e tratá-los com um agonista de NPFFR2 para induzir a liberação de neurotransmissores, CGRP e a SP. A dependência de NPFFR2 mais é testada usando NPFFR2 pequena interferência do RNA (siRNA), que pode transfected em culturas de células de DRG.
Protocol
Representative Results
Discussion
No presente artigo, demonstramos a coleção, enzima-dissociação e cultura de lombar rato DRG. Com o apoio de neurotrophic de NGF, os axônios dos neurônios DRG estendido dentro de 3 dias após a semeadura da célula. Os axônios estendidos foram claramente observáveis após células foram coradas para proteína CGRP, o qual é sintetizada no soma de célula e transportada ao longo das fibras de axônio. Os processos de células satélites também estendidos, permitindo que estas células gliais divisórias cercar os…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos o Dr. M. Calkins para edição inglesa. Este trabalho foi apoiado pelo Chang Gung Memorial Hospital (CMRPD1F0482), Chang Gung University, centro de pesquisa de envelhecimento saudável (EMRPD1G0171) e Ministério da ciência e tecnologia (105-2320-B-182-012-MY2).
Materials
| Mixture of tiletamine and zolazepam (Zoletil) | Virbac | Zoletil 50 | anaesthetic |
| Fetal bovine serum | Biological Industries | 04-001-1 | Culture Medium |
| sodium pyruvate | Sigma | S8636 | Culture Medium |
| penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-033-1 | Culture Medium |
| DMEM-F12 | Invitrogen | 12400024 | Culture Medium |
| Poly-l-lysine | Sigma | P9011 | Coating dish |
| Collagenase IA | Sigma | 9001-12-1 | Enzyme digestion |
| Hank's balanced salt solution | Invitrogen | 14170-112 | Culture Medium |
| Trypsin EDTA | Biological Industries | 03-051-5 | Enzyme digestion |
| Pasteur pipette | Hilgenberg | 3150102 | Cell trituration |
| Cytarabine (Ara-C) | Sigma | C6645 | Culture Medium |
| NGF | Millipore | NC011 | Culture Medium |
| NPFFR2 siRNA | Dharmacon | L-099691-02-0005 | Transfection |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | L-001810-10-05 | Transfection |
| NeuroPORTER Reagent | Genlantis | T400150 | Transfection reagent |
| dNPA | Genemed Synthesis | N/A | NPFFR2 agonist |
| CGRP ELISA | Cayman | 589001 | EIA |
| SP ELISA | Cayman | 583751 | EIA |
| CGRP antibody | Calbiochem | PC205L | IHC |
| DAPI | Roche | 10236276001 | IHC |
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