장 술 셀 부동성 마우스 공장 Cryosections에 시각화에 안티 인 girdin 항 체의 사용

여기에 설명 된 모든 방법 동물 관리 및 사용 발달 연구, 아이치 휴먼 서비스 센터에 대 한 연구소의 위원회에 의해 승인 되었다 (출원 번호: M-03). 1입니다. 준비 10 L 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)의 준비: 32.27 g Na2HPO4·12H2O, NaH2포4·2H2O, 4.5 g의 NaCl의 80.0 g 실 온 (RT)에서 10 L. 저장소 솔루션의 최종 볼륨을 초순에 추가. PBS-t: 200 mL의 PBS의 단계 1.1에서에서 polyoxyethylene(10) octylphenyl 에테르의 100 µ L 0.05% (vol:vol)의 최종 농도에 200ml를 준비 합니다. 실시간에 저장소 장갑과 눈 보호를 입고, 하는 동안 버퍼링 10% 중성 포 르 말린 용액에 15% 자당의 50 mL 준비: 자당 10%에 추가의 7.5 g을 50 mL의 최종 볼륨 중성 포 르 말린 솔루션 (자료 테이블) 버퍼링. 실시간에 저장소주의: 버퍼링 10% 중성 포 르 말린 용액에 포름알데히드와 흡입 또는 피부 또는 눈 접촉 위험 수 있습니다. 신중 하 게 처리 합니다. 200 단위/mL phalloidin 형광 염료 어원이 재고 솔루션의 1.5 mL를 준비: phalloidin 형광 염료 켤레 (1 유리병, 동결 건조 된 고체, 여기 및 방출 파장 300 단위: 581 및 609 nm, 각각)의 1.5 mL에 메탄올입니다. -20 ° c.에 어둠 속에서 저장소 솔루션 준비 5 mg/mL 4′, 6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) 재고 솔루션: N, N-dimethylformamide (DMF) 2 mL에 DAPI 10 밀리 그램. -20 ° c.에 어둠 속에서 저장소 솔루션 5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) PBS에서 준비: 0.5 g, BSA의 PBS의 10 mL. 4 ° c.에 게 집게를 사용 하 여 18-게이지 바로 바늘의 경사진된 끝을 제거 하 고 액체 바늘 루멘 (그림 1A1)을 통해 흐름을 수 있도록 세로 방향으로 핀 처와 물린된 끝을 꼬집어.참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 2. 동물 해 부와 공장의 절연 마우스의 관류 고정 장갑을 착용 하 고 통풍이 잘되는 지역에서 작동. 100 mL 유리 비 커를 준비, 10% 중성 포 르 말린 솔루션, 수술 도구 (가 위, 집게), 금속 트레이 버퍼링, 6-0 나일론 봉합, 1.7, 같이 준비 18 게이지 바로 바늘 22 게이지 날개 달린된 바늘, 20 mL 주사기. 20 mL 주사기에 유리 비 커에서 버퍼링 10% 중성 포 르 말린 용액 20 mL를 로드 하 고 콘센트에 연결할 22 게이지 날개 달린된 바늘. 50 mL 원심 분리기 튜브에서의 PBS (최종 5% 젤라틴) 20 mL에 젤라틴 가루 1 g을 추가 하 여 액체 젤라틴을 준비 합니다. RT에 15 분 동안 몸을 담근 채, 후 동요 없이 15 분 동안 물 목욕에서 50 ° C에서 품 어. 짧게 소용돌이, 그리고 또 다른 15 분 완전히 젤라틴 분해 50 ° C에서 품 어. 사용까지 RT에 튜브를 둡니다. 자 궁 경부 전위에 의해 성인 마우스를 안락사. 금속 쟁반에 단계의 2.1.6 마우스를 놓고 수술 도구를 사용 하 여 ensiform 연골을 통해 피부에 작은 절 개를 하 게 합니다. 흉부와 복 부 지역 노출 양손으로 절 개를 확장 합니다. 노출 횡 경 막, 복 막 열고 양쪽에 다이어 프 램을 엽니다. 흉부 새 장 양쪽 모두 앞쪽 axillary 라인을 따라 잘라 다음 마음을 노출 thymus의 위치에서 가로 방향으로 절단 하 여 흉 벽을 제거 합니다. 혈액을 배수 하 고 좌 심 실의 꼭대기에 22 게이지 날개 달린된 바늘을 삽입 하는 오른쪽 아 트리 움의 auricle에 작은 절 개를 확인 합니다. Perfuse 버퍼 10% 중성 포 르 말린 솔루션으로 조직에 플런저를 밀어. 골반에 장기 노출 후, 항문에서 직장의 끝을 잘라 하 고는 mesentery를 절단 하 여 시체에서 내장을 분리 합니다. 공장을, 4cm 위 동굴의 항문 쪽에서에서 내장을 잘라. 나머지 소장의 항문 절반을 삭제 합니다. 반 물 내리는 절차를 촉진 하기 위하여 공장을 클립. 부하 20 mL의 10% 중성 포 르 말린 용액 20 mL 주사기에 버퍼링 고 18 게이지 바로 바늘 단계 1.7 콘센트에서에서 준비를 연결 합니다. 잘린된 공장 장의 내용을 제거 하 고 창 자 루멘 표면 (그림 1A2)를 해결 하기 위해의 한쪽 끝에서 버퍼링 10% 중성 포 르 말린 솔루션을 주입. 2.1.15 단계에서 설명한 대로 PBS를 주입 하 여 창 자 루멘을 씻어. 2.1.15 액체 젤라틴 PBS 바꿉니다 단계에서 설명한 대로 창 자 루멘에 액체 젤라틴을 플러시. 6-0 나일론을 사용 하 여 봉합 결 찰에 의해 잘린된 공장의 가까이 한쪽 잘라 봉합 하 고 액체 젤라틴 공장 채울 봉합 결 찰 (그림 1A3)에 의해 반대쪽 끝을 닫습니다. Cryomold (그림 1A4)의 우울된 부분에 소시지 모양의 공장 섹션에 맞게 4 봉합 사 매듭을 추가 합니다.참고: cryomolds는 20 m m x 25 m m x 5 m m 우울된 섹션으로,에 대 한 ~ 20 밀리미터 소시지 같은 공장 섹션이 바람직합니다. 4 ° c.에서 하룻밤 버퍼링 10% 중성 포 르 말린 용액에 15% 자당의 50 mL에 조직을 담근 다참고: 이러한 단계 젤라틴 및 조직의 포 르 말린에 의해 자당 및 단백질 고정 하 여 cryoprotection을 확인합니다. 실시간에 고정 되지 않은 gelatinized 젤라틴 4 ° C에서 녹는 반면 말린 gelatinized 젤라틴 RT에 녹여 하지 않습니다. 3. 젤라틴 가득 공장 조직의 스냅 봉합 사 매듭에 공장을 잘라서 출혈 양쪽으로 3 개의 소시지 같은 공장 조각 (그림 1A4) 얻을 수 있습니다. 소시지와 같은 조각 포함 동결된 조직 표본의 준비에 대 한 화합물의 추가 대 한 cryomold에 맞춥니다. 스냅 동결에 액체 질소로 냉각 isopentane cryomold. Cryomolds-80 ° C에서 저장참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 4. 면역 형광이 술의 부동성 Cryosections를 사용 하 여 세포 Cryosectioning -22 ° c cryostat 챔버 온도 (CT) 및 개체 온도 (OT)를 설정 장소 냉동된 조직 적어도 15 분 동안 cryostat 챔버에 cryomold에서 차단 합니다. 35 m m 문화 접시에 PBS의 3 mL를 추가 합니다. cryomold에서 냉동된 조직 블록을 제거 하 고 공장의 횡 근 섹션 노출 면도날으로 반 블록을 잘라. 탑재 한 척 (cryostat 어댑터) 절단 평면 면도날을 섹션에 블록의 절반. 섹션 30 µ m 두께 섹션으로 젤라틴 가득 공장. 사용 고정 집게를 부드럽게 준비 단계 4.1.2 (그림 2B오른쪽)에서 35 m m 문화 접시에 섹션을 전송 합니다. 1 차 항 체의 응용 각 상호 통에 가벼운 떨고와 3 mL PBS-T와 함께 5 분에 대 한 3 회 35 m m 문화 접시에 부동성 섹션을 세척 (약 36 회 / 분). Antigen 검색 솔루션 준비: 초순 2.7 mL에 항 원 검색 솔루션 집중 (자료 테이블)의 0.3 mL. 부동성 섹션을 포함 하는 35 m m 문화 접시에 항 원 검색 솔루션의 3 mL를 추가 합니다. 뚜껑을 닫고, 접시와 뚜껑 비닐 테이프의 스트립 사이의 간격을 밀봉 하 고 동요 하지 않고 3 h에 대 한 교 잡 인큐베이터에서 50 ° C에서 품 어. 인큐베이터를 20 분에 대 한 RT에서 멋진 요리를 제거 합니다. 비닐 테이프를 제거 후 씻어 3 시간 5 분 동안 각 3 mL와 함께 PBS-T와 온화한 동요의 섹션. PBS-T 발음을 섹션에 차단 솔루션 (자료 테이블)의 5 방울을 추가 합니다. 온화한 동요와 함께 5 분 RT에서 품 어. 1 차적인 항 체 솔루션 준비: 인 Y1798 (pY1798) girdin 항 체 (자료 테이블)의 5 µ L와 PBS에서 5 %BSA 495 µ L. 1 차적인 항 체 (차단 솔루션이 필요 하지 않습니다 제거) 섹션에 솔루션의 500 µ L를 추가 합니다. 부 화 습도 챔버에 접시를 놓고 가벼운 떨고와 4 ° C에서 밤새 품 어.참고: 하룻밤 외피는 최대 3 박에 확장할 수 있다. 이차 항 체의 응용 워시 3 번 5 분 동안 각 3 ml에서 PBS-T 가벼운 진동의 섹션. 희석된 DAPI 재고 솔루션을 준비: DAPI 재고 솔루션 (단계 1.5), PBS의 998 µ L의 2 µ L. 이차 항 체 솔루션: PBS, 희석된 DAPI 솔루션, phalloidin-형광 염료 어원이 재고 솔루션의 12.5 µ L, 염소-토끼 IgG-형광 염료 켤레의 1 µ L의 10.5 µ L에에서 5 %BSA 476 µ L (파장: 여기 496 nm, 방출 520 nm). PBS-T 발음, 후 이차 항 체 솔루션을 적용 하 고 온화한 떨고와 30 분 RT에서 빛 차폐 인큐베이션 챔버에 품 어. 3 시간 5 분 동안 각 3 mL와 함께 PBS-T와 온화한 동요의 섹션을 씻어. 최종 세척 후 PBS-T를 제거 하 고 polyoxyethylene(10) octylphenyl 에테르 부족 PBS의 3 mL을 바꿉니다. 입체 음향 현미경에 접시를 전송. 장소 200 µ L의 PBS P200 피펫으로 팁을 사용 하 여 작은 물방울에 접시에서 매스 코팅 흰색 유리 슬라이드와 이전 한 공장 섹션의 중앙에 작은 물방울에서. 입체 현미경 섹션 맞춤 조정 후 섹션을 둘러싼 모든 나머지 PBS 발음. 수성 설치 미디어의 20 µ L을 추가 하 고 미디어 꼭대기 20 x 20 m m coverslip 장소. 즉시 크 실 렌 기반 설치 미디어와 함께 coverslip 가장자리 물개. 나무 mappe에 슬라이드를 놓고 2-3 h에 대 한 RT를 공고히 자일 렌 기반 설치 미디어를 허용 합니다.참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 자일 렌 기반 설치 미디어 굳은 후 슬라이드 실시간에 빛 차폐 슬라이드 상자에 2-3 주 동안 저장 될 수 있습니다. 5. confocal 현미경 검사 법 공초점 현미경의 63 X 목표에 집중 기름을 넣어. Coverslip 슬라이드를 거절 하 고 무대에 슬라이드를 놓습니다. 레이저 파장 405, 488, 555 nm, 인수 TC 이미지를 디지털화 하 고 tiff 형식 (.tiff) 이미지를 저장 합니다.참고: 형광 염료에 대 한 적절 한 검색 필터 세트를 선택 (즉, 여기/방출 맥시 마: 358/461 nm, 490/525, 및 590/617).