Summary

Entier-Montez la microscopie confocale pour la peau de l’oreille d’adulte : un système modèle pour étudier la morphogenèse ramification Neuro-vasculaire et la Distribution de cellules immunitaires

Published: March 29, 2018
doi:

Summary

Nous décrivons ici une méthode d’imagerie de haute résolution entier-montent dans la peau d’oreille de souris adulte entier, qui nous permet de visualiser la ramification de la morphogenèse et structuration des nerfs périphériques et les vaisseaux sanguins, ainsi que distribution de cellules immunitaires.

Abstract

Nous présentons ici un protocole d’une peau d’oreille d’adulte entier-montent d’imagerie technique pour étudier la morphogenèse de ramification neuro-vasculaire tridimensionnelle complète et structuration, ainsi que distribution de cellules immunitaires au niveau cellulaire. L’analyse des structures anatomiques nerveuses et des vaisseaux sanguins périphériques dans les tissus adultes fournit un aperçu de la compréhension du câblage neuro-vasculaire fonctionnelle et la dégénérescence neuro-vasculaires dans certaines pathologies telles que la cicatrisation des plaies. Comme système modèle hautement instructif, nous avons concentré nos études sur peau d’oreille d’adulte, qui est facilement accessible pour la dissection. Notre protocole simple et reproductible fournit une description précise des composants cellulaires de la peau entière, tels que les nerfs périphériques (axones sensoriels, axones sympathiques et les cellules de Schwann), des vaisseaux sanguins (cellules endothéliales et les cellules musculaires lisses vasculaires ) et des cellules inflammatoires. Nous croyons que ce protocole préparera le terrain pour enquêter sur des anomalies morphologiques dans les nerfs périphériques et les vaisseaux sanguins, ainsi que l’inflammation dans la peau de l’oreille d’adulte dans des conditions pathologiques différentes.

Introduction

La peau se compose de trois couches : épiderme, derme et hypoderme. Il a servi comme modèle pour étudier les cellules souches entretien, différenciation et morphogenèse en développement ainsi que la régénération, tumorigenèse et l’inflammation chez les adultes. La peau est richement vascularisée et innervée tels que le développement du système nerveux périphérique et du système vasculaire est bien coordonné.

Nous avons déjà démontré une technique d’imagerie entier-Montez la peau embryonnaire avec étiquetage multiples pour l’étude des nerfs périphériques intacts et les vaisseaux sanguins, y compris leurs composants cellulaires1,2,3, 4: axones sensoriels, axones sympathiques, Schwann dans les nerfs, les cellules, les cellules endothéliales, péricytes et cellules de muscle lisse vasculaire (CMLV) dans les vaisseaux sanguins. Au cours de l’angiogenèse, un premier réseau capillaire subit un remodelage vasculaire intense et se développe en un réseau de ramification vasculaire hiérarchique. Dans le derme en développement/hypoderme, artères branche aux côtés des veines et des nerfs sensoriels périphériques puis forment adjacentes aux artères. Une fois le réseau vasculaire hiérarchique est complètement recouvert de CMLV, nerfs sympathiques s’étendent le long et innervent le grand diamètre des vaisseaux sanguins1,5,6. Malgré l’importance de l’association étroite entre les développement des systèmes nerveux et vasculaires, une question importante a consisté à aborder ce qui se passe aux réseaux neuro-vasculaires dans diverses situations pathologiques chez l’adulte. Une imagerie de haute résolution en trois dimensions est nécessaire pour apprécier la pathogenèse, ainsi que de la morphogenèse ramification reconnaissable anatomiquement et structuration.

Morphogenèse neuronale et vasculaire dans la peau de souris adulte est couramment analysée par la coloration de la section de tissu. D’autres études ont utilisé entier-Montez l’imagerie de la peau pour visualiser les nerfs périphériques et les vaisseaux sanguins, en plus les follicules pileux, glandes sébacées et arrecteur pili muscles7,8,9. Cependant, l’épaisseur de la peau adulte a rendu difficile analyser la peau dans son ensemble de la profondeur.

Dans la présente étude, nous avons développé une nouvelle imagerie haute résolution d’entier-montent de peau d’oreille d’adulte pour surmonter ces difficultés. Peau de l’oreille est facilement accessible pour la dissection et l’imagerie entier-Montez subséquent de la peau sur l’ensemble de la profondeur. Ainsi, c’est une méthode simple et hautement reproductible qui peut être appliquée pour comparer l’architecture tridimensionnelle des systèmes nerveux et vasculaires périphériques dans la peau, avec des mesures de quantification globale. Nous avons démontré que l’alignement des nerfs sensitifs et sympathiques périphériques avec grand diamètre des vaisseaux sanguins est préservée dans la peau de l’adulte. Le but du présent protocole est de visualiser la ramification de la morphogénèse et la structuration des nerfs périphériques et les vaisseaux sanguins, ainsi que la distribution des cellules immunitaires au niveau cellulaire dans les modèles de souris adulte dans diverses conditions telles que l’inflammation et régénération.

Protocol

Toutes les expériences dans cette section ont été effectuées en vertu de l’approbation de la National Heart, Lung et Blood Institute (NHLBI) et animalier Comité d’urbanisme. 1. adult Mouse Ear peau Collection Euthanasier des souris adultes par l’exposition de dioxyde de carbone (CO2) dans une chambre fermée, puis vérifiez l’euthanasie par dislocation cervicale.Remarque : L’expérience fait suite à la recommandation de la National Institutes of Health…

Representative Results

Souris adulte oreille postérieure (Figure 1 a) et peaux oreille antérieure (Figure 1 b) ont été immunomarquées avec anticorps anti-αSMA (rouge), Tuj1 (vert) et PECAM-1 (bleu). Peau postérieure a été immunomarquées pour étudier la distribution de neuro-immunitaire à l’aide d’anticorps anti-CD11b (rouge) et MBP (vert), ainsi que Tuj1 (bleu) (Figure 2 a). Distribution de CD11b+</sup…

Discussion

Ce protocole décrit l’imagerie immunonohistochemical entiers de peau d’oreille d’adulte pour l’analyse des structures neuro-vasculaires et de la distribution de cellules immunitaires. Nous croyons que cette méthode a de nombreux avantages expérimentales aux chercheurs d’étudier la ramification de la morphogénèse et la structuration des nerfs périphériques et les vaisseaux sanguins, ainsi que la répartition en trois dimensions des composants de peau y compris les cheveux et les cellules immunitaires fol…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions la direction du laboratoire de K. Gill et appui technique, J. Hawkins et le personnel du National Institutes of Health (NIH) construction animalerie 50 pour l’aide avec soin de la souris et R. Reed et F. bartherline pour l’assistance administrative. Merci aussi à Motegi S. et M. Uwimana pour le partage de leur protocole de dissection du peau oreille, N. Burns pour aide rédactionnelle et les membres de la laboratoire de cellules souches et biologie Neuro-vasculaire de l’aide technique et une discussion réfléchie. T. Yamazaki a été appuyée par la société japonaise pour la Promotion of Science (JSPS) NIH-KAITOKU. Ce travail a été soutenu par le programme de recherche intra-muros du National Heart, Lung, and Blood Institute (HL005702-11 à Y.M.)

Materials

10 x Phosphate Buffered Saline KD Medical RGE-3210 PBS, without Ca2+/Mg2+
Hank’s Balanced Salt Solution Gibco 14025-092 HBSS, with Ca2+/Mg2+
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 PFA, fixative, diluted in PBS
Triton X-100 Sigma X100 Detergent
Normal goat serum Gibco 16210064 Component of blocking/washing buffer
Normal donkey serum Jackson Immuno research 017-000-121 Component of blocking/washing buffer
Curved fine tweezers Dumont RS-5047
Curved tweezers Integra Miltex Vantage V918-782, V918-784
Filter Unit 0.45 mm Thermo Scientific 157-0045 For filtration
1 mL syringe Coviden 8881501400 For filtration
Syringe filter Unit 0.22 mm Millex-GV SLGVR04NL For filtration
ProLong Gold Thermo Scientific P36934 Anti-fade mounting medium
Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180 For sealing
Dissecting microscope Leica MZ95
Confocal microscope Leica TCS SP5
Photoshop CC 2017 Adobe Graphics editor software
Illustrator CC 2017 Adobe Graphics editor software
Image J NIH Image processing software
Anti-PECAM-1 (CD31) antibody Millipore MAB1398Z Hamster IgG, vascular endothelial cell marker, 1:300
Anti-PECAM-1 (CD31) antibody BD Pharmingen 553369 Rat IgG2a kappa, vascular endothelial cell marker, 1:300
Anti-aSMA antibody conjugated with cy-3 Sigma C6198 Mouse IgG2a, vascular smooth muscle cell marker, 1:500
Anti-EphB1 antibody Santa Cruz sc-9319 Goat polyclonal, venous endothelial cell marker, 1:100
Anti-neuron-specific Class III b-tubulin (Tuj1) Abcam AB18207 Tuj1, Rabbit polyclonal IgG, pan-axonal marker, 1:500
Anti-Tuj1 antibody Covance MMS-435P Mouse IgG2a, pan-axonal marker, 1:500
Anti-MBP antibody Abcam AB40390 Rabbit polyclonal IgG, myelination marker, 1:200
Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody Chemicon AB152 Rabbit polyclonal, sympathetic neuron marker, 1:500
Anti-Peripherin antibody Chemicon AB1530 Rabbit polyclonal, peripheral neuron marker, 1:1000
Anti-CD11b antibody Bio-Rad MCA74G Rat IgG2b, inflammatory cell marker (macrophages), 1:50
Anti-CD45 antibody Thermo Fisher Scientific 14-0451-85 Rat IgG2b kappa, pan-hematopoietic cell marker, 1:500
Anti-CD3 antibody Bio-Rad MCA1477T Rat IgG1, immune cell marker, 1:100
Anti-CD45R (B220) antibody Thermo Fisher Scientific 14-0452 Rat IgG2a kappa, inflammatory cell marker, 1:200
Anti-GFP antibody Thermo Fisher Scientific A11122 Rabbit polyclonal, 1:300
Anti-GFP antibody Abcam Ab13970 Chicken polyclonal, 1:500
Anti-b-gal antibody Cappel 55976 Rabbit polyclonal, 1:5000
Anti-RFP antibody Abcam Ab62341 Rabbit polyclonal, 1:300
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa 488 Thermo Fisher Scientific A11034 Rabbit polyclonal secondary antibody, 1:250
Goat anti-hamster IgG (H+L) Alexa 647 Jackson Immuno research 127-605-160 Hamster polyclonal secondary antibody, 1:250
Goat anti-rat IgG (H+L) Alexa 594 Jackson Immuno research 112-585-167 Rat polyclonal secondary antibody, 1:250
Goat anti-mouse IgG2a Alexa 633 Thermo Fisher Scientific A21136 Mouse IgG2a secondary antibody, 1:250

Referenzen

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Diesen Artikel zitieren
Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution. J. Vis. Exp. (133), e57406, doi:10.3791/57406 (2018).

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