含有单链 amphiphiles 的脂质体, 特别是脂肪酸, 与含有 diacylphospholipids 的单链 amphiphiles 的独特化学性质相比, 具有明显的特性。在这里, 我们描述的技术, 以制备, 纯化和使用脂质体组成的部分或整个这些 amphiphiles。
含有单链 amphiphiles 的脂质体, 特别是脂肪酸, 与含有 diacylphospholipids 的人相比, 由于这些 amphiphiles 的独特化学性质而具有明显的特性。特别是脂肪酸脂质体由于单链 amphiphiles 的溶解度较高而增强了动态特性。同样, 含有游离脂肪酸的脂质体对盐和价阳离子更敏感, 这是由于羧酸头基团与金属离子之间的强相互作用。在这里, 我们说明了制备、纯化和使用由单链 amphiphiles (例如、油酸) 组成的脂质体的技术。
脂质体, 或囊泡-由两亲脂组成的双层膜所包围的隔间, 在许多生物医学应用中被用作药物、细胞膜模型和合成细胞.我们和其他人也在早期使用脂质体作为原始细胞膜的模型。1,2,3,4通常, 在这种系统中, 我们使用单链 amphiphiles, 仅包含一个脂质烃尾 (例如, 油酸), 因为这些分子在没有现代细胞所使用的编码蛋白酶的益处的情况下更容易合成。
由单链脂组成的脂质体类似于从 diacylphospholipids (例如、1-棕榈酰-2-油酰–sn glycero-3-phosphocholine 或 POPC) 中形成的, 因为边界由双层膜组成。由两种脂质组成的脂质体可以保留溶解的有效载荷, 并可通过不同的技术进行裁减和纯化。由于单链脂质的独特化学特性, 有几个重要的差异。磷脂形成的囊泡在广泛的 ph 范围内是稳定的, 而脂肪酸泡只在中性至温和的碱性 ph 值 (约 7-9) 稳定, 这需要一定的 ph 缓冲剂进行囊泡制备。在大多数情况下, 这个缓冲也可能包含特定的可溶性分子囊泡封装, 它可以是功能性材料 (例如, RNA) 为分开的生物化学反应或简单的荧光染料 (例如, calcein) 用于囊泡特征。
只有单一的碳氢化合物链的存在, 产生的膜, 这是一个更渗透到溶质, 以及更多的动态。此外, 富含脂肪酸的羧酸头组产生的囊泡对盐和价阳离子的存在更敏感 (例如, Mg2 +)。镁是催化原始细胞生化反应的最重要的价阳离子之一, 用于生命起源的研究。在早期的生活中, 在成熟的蛋白质酶进化之前, RNA 可能是主要的聚合物, 由于它的双重能力自我复制和执行催化作用。一个有代表性的镁需要 rna 相关反应的例子是非酶 rna 复制, 第一次证明在二十世纪六十年代。5当化学活化的 RNA 核苷酸 (即2-methylimidazolide 核苷酸) 与原有的底漆模板复合物绑定时, 底漆的 3 ‘-羟基基团攻击相邻活性单体的 5 ‘-磷酸盐, 以取代离开组 (即2 甲基咪唑), 并形成新的磷酸二酯键。这种 RNA 复制化学需要高浓度的 Mg2 +, 这需要螯合, 以配合脂肪酸原始细胞。6另一个 Mg2 +依赖的反应是由锤头核酶催化的, 这也许是最具特色的催化 RNA。这种核酶可以从两个短寡核苷酸中重组, 执行一种自解切反应, 便于通过凝胶移位来监测。因此, 它经常被用作生物起源研究中的模型核酶。7由于此核酶对 unliganded 镁的要求, 脂质体通常是由脂肪酸和脂肪酸甘油酯的混合物构建的, 对镁更稳定。8,9在本协议中, 我们介绍了我们为制备、操作、表征这些囊泡而开发的技术, 并演示了这些囊泡作为原始细胞, 用于宿主非酶 RNA 复制和锤头核酵素的应用。催化.
由脂肪酸组成的脂质体由于其高的渗透性和动态特性, 被许多人认为是原始细胞的潜在模型。单链脂肪酸的羧酸头组只允许在有限的 pH 范围内将自组装成膜, 由此产生的膜对盐的存在相当敏感。因此, 与磷脂囊泡相比, 脂肪酸泡需要不同的制备和处理方法。
在本议定书中, 虽然我们用油酸作为脂质体形成的例子, 其他长链不饱和脂肪酸 (C14) 及其衍生物 (肉豆蔻油酸, 棕榈油酸, 相应的醇和甘油酯) 也形成囊泡采用薄膜补液法, 只要总脂浓度高于 cmc, 水化缓冲 pH 值接近膜内脂肪酸的 pKa。除了在本协议中使用的三 HCl 缓冲区之外, 还报告了其他缓冲系统 (ca bicine、磷酸盐、硼酸盐) 支持脂肪酸囊形成, 尽管磷酸盐或硼酸盐缓冲液中形成的囊泡通常是相当漏水的13。在补液后产生的脂肪酸囊多分散和 multilamellar, 但容易转化为小单分散 unilamellar 囊挤压, 如所述。与超声波作为小泡产生的替代方法相比, 挤压为不同孔径膜的囊泡大小的控制提供了更多的选择。挤压后的囊泡通常比膜孔尺寸稍大, 但通过增加挤出循环的次数, 可以获得较窄的粒度分布的囊泡和平均尺寸接近膜孔径的大小。
为了合成功能性原始细胞, 脂肪酸囊需要宿主特定的生化反应产生的 RNA 或其他积木的封装。薄膜补液方法为形成含有所需封装材料的囊泡提供了一种简便的方法。然而, 封装效率相对较低, 而在纯化过程中, RNA 等珍贵材料中的一大小部分通常会丢失。在某些情况下, 在挤出前重复冻融循环可以适度地提高封装效率。微流控法用于磷脂脂质体的高产制备, 允许近100% 的封装效率, 但是还没有开发出用于脂肪酸泡的类似方法。
当处理原始细胞与螯合或自由镁2+, 净化后, 镁溶液添加和 repurification 之前, 每个时间点确保清除泄漏的封装材料可能影响的准确性的反应速率在囊泡内测量。由于每种纯化都需要至少10分钟才能取得良好的分离, 并收集囊泡馏分, 快速反应的分析是困难的, 必须在柱 repurification 之前停止反应。
我们在这里所提供的协议非常适合于构建脂肪酸脂质体, 宿主反应模仿那些可能发生在原始细胞中。我们的协议还可以在开发生物医学交付系统和其他生化反应反应器方面发挥潜在的应用价值。
The authors have nothing to disclose.
J.W.S. 是霍华德休斯医学研究所的一名调查员。这项工作部分是由西蒙斯基金会的赠款 (290363) 支持 J.W.S。A.E.E. 和 K.P.A. 都承认明尼苏达大学启动基金的支持。
sephorose 4B | SIGMA-ALDRICH INC | 4B200 | |
calcein | SIGMA-ALDRICH INC | C0875-10G | |
tris-HCl pH8.0 1M | LIFE TECHNOLOGIES CORP | AM9851 | |
citric acid | SIGMA-ALDRICH INC | 251275-500G | |
sodium hydroxide | SIGMA-ALDRICH INC | 71690-250G | |
potassium hydroxide | Sigma | 30614 | |
oleic acid | Nu-Chek | U-46-A | |
glycerol monooleate | Nu-Chek | M-239 | |
Liss Rhodamine-PE | LIFE TECHNOLOGIES CORP | L1392 | |
magnesium chloride | Fisher/Thermo Fisher Scientific | AM9530G | |
sequagel concentrate | National Diagnostics | EC-830 | |
sequagel DILUENT | National Diagnostics | EC-840 | |
15% TBE-UREA GEL | Thermo Fisher Scientific | EC68852BOX | |
urea | Sigma Aldrich | U6504-500G | |
titon-100x | SIGMA-ALDRICH INC | T9284-100ML | |
RNA primer | IDT | 5'Cy3-GCG UAG ACU GAC UGG | |
RNA template | IDT | 5'-AAC CCC CCA GUC AGU CUA CGC | |
hammerhead substrate strand | IDT | 5'Cy3-GCG CCG AAA CAC CGU GUC UCG AGC | |
hammerhead ribozyme strand | IDT | 5'GGC UCG ACU GAU GAG GCG CG | |
vesicle extruder set | AVANTI POLAR LIPIDS | 610000 | |
fraction collector | Gilson, Inc. | 171041 | |
96-well plates | Fisher | NC9995941/675 | |
plate reader | Molecular Devices | SpectraMax i3 | |
confocal microscope | Nikon | Nikon A1R MP Confocal | |
gel scanner | GE Healthcare Life Sciences | Typhoon 9410 scanner |