三维肽支架中哺乳动物细胞的培养

1. 自组装肽支架 (sap) 的制备 在微离心管中, 用 20% (w/v) 蔗糖制备0.5% 肽 RAD16-I 溶液。油脂实验在超声波浴中以最大功率和室温 (RT) 为20分钟的肽溶液, 以确保均匀混合。注: 要准备的解决方案数量将取决于所需胶囊的数量。RAD16-I 肽在这些超声波条件下不受降解。 稀释在步骤1.1 中制备的多肽溶液, 所需量为 10% (瓦特/v) 蔗糖, 以获得所需的最终浓度。注意: 要考虑的一个重要因素是初始肽浓度的调整, 因为最终的矩阵刚度将取决于这个参数。RAD16-I 肽溶液应比3D 结构所期望的最终浓度高2x。通常, 使用的最终 RAD16-I 肽浓度介于 0.15–0.5% (v.) 之间。 将含有肽溶液的微离心管放入20分钟的超声波浴中, 确保均匀混合。注: 肽溶液, 如果不立即使用, 可以储存几个月在4摄氏度。 2. 细胞悬浮制剂 离心机细胞悬浮液 (在胰蛋白酶治疗后获得) 在 60 x g 和 RT 为5分钟。 使用连接到真空线的巴斯德吸管去除上清液, 用微将 10% (3–5) 蔗糖中的细胞颗粒悬浮。使用手动或自动单元格计数器进行计数单元格。注: 10% (w/v) 蔗糖溶液是一种等渗和非离子介质, 允许细胞维护和避免肽凝胶在混合过程中。 离心机细胞悬浮在 60 x g 和 RT 为5分钟. 取出上清液, 再将细胞颗粒悬浮在必要体积 10% (瓦特/v) 蔗糖中, 以获得双倍的预期最终细胞浓度 (可推荐约 4 x 106细胞/毫升)。 在6井板的每个井中放置所需数量的组织培养插入物 (每个封装一个插入)。 油脂实验在步骤1中制备的多肽溶液, 最大功率和 RT 为5分钟。 吸管并且安置40µL 细胞悬浮 (获得在 2.3) 为每个被要求的封装加大约10–15% 额外容量入标准微离心管。 3. 3D 细胞封装到 sap 中 将 RAD16-I 溶液的等量体积混合在10% 蔗糖 (w/v) (40 µL 每封装), 并在步骤2中制备的细胞悬浮量 (每封装40µL) 相等, 以获得所需肽浓度的细胞悬浮 (10% 蔗糖)。混合吹打慢慢上下大约10次。在混合过程中避免气泡形成。注意: 这一步是至关重要的, 必须非常小心地执行, 因为细胞是在敌对条件下由于低 pH 肽 (大约 3.5–4.0)。 使用微, 仔细加载80µL 的悬浮到每个插入。 将0.5 毫升培养基添加到井底湿润插入膜, 使介质扩散促进肽自组装和凝胶形成。让肽凝胶在流动柜中大约20分钟。注: 在设定时间内对样品的操纵可能以凝胶破裂告终。 非常缓慢地添加40µL 中的插入, 让它向下滑动内壁到凝胶。注意: 通常, 此卷的加载应在20–30之间进行。 将板材放在孵化器中 (37 °c, 5% CO2, 湿润气氛) 为20分钟。这一步骤和连续培养基添加将有利于浸出的蔗糖和平衡细胞与培养基。 将60µL的介质添加到插入的内壁 , 使其沿着墙向动。吸入富含蔗糖的井中的培养基, 加入0.5 毫升的新鲜培养基。 添加60µL 的培养基慢慢地插入和放置在孵化器 (37 °c, 5% CO2, 湿润的气氛) 的板块10分钟。 吸入井中的介质, 并在井中加入2.5 毫升的新鲜培养基。在插入中添加200µL 介质。将盘子放在孵化器中 (37 °c, 5% CO2, 湿润气氛), 以维持细胞在适当的条件下。 每天改变媒体。从井底取出旧介质。添加2.5 毫升的新鲜培养基到井和200µL 到插入。注: 如果细胞分化继续, 特定的诱导培养基将被添加到文化中, 导致所需的细胞类型承诺 (见下文,细胞分化)。 4. 3 个 d 型结构的细胞存活能力 注: 细胞生存能力检测被称为活/死-生存能力/细胞毒性试验。 在15毫升管中, 十年代 homodimer-1 在 PBS 中准备2µM calcein AM 和2µM 溴 EthD-1 (涡流) 的新溶液的必要体积. 保持在黑暗中。注: 每个样品所用的体积取决于井身尺寸: 6 多井板每井2毫升;1毫升为每井12多井板和0.5 毫升为每井24多井板材。 使用微, 用2毫升的 PBS 冲洗 3 d-结构调整器样本3次, 然后用步骤4.1 中准备的溶液覆盖。在黑暗中孵化40分钟。 使用微, 冲洗2毫升 PBS 5 倍的结构。 使用10X 或20X 放大器在荧光显微镜下可视化样品。 5. 细胞分化 培养细胞 (37 °c, 5% CO2, 湿润大气) 在软骨基底培养基 (煤层气) 与生长补充剂。注: 介质的准备工作在制造商的说明书中描述 (见材料表)。 在2天诱导细胞分化的软骨培养基含有重组人转化生长 factor-b1 [TGFb1] (10 ng/毫升), l-抗坏血酸 2-磷酸盐 [AA2P] (25 µg/毫升) 和地塞米松 (100 nM)。 在37摄氏度和 5% CO2的恒温环境中保持4周的培养。每隔一天更换软骨介质。 6. 甲苯胺蓝 (结核) 染色 通过添加并移除2毫升的 PBS 与微, 洗净 3 d-结构的文化。通过在 PBS 中加入2毫升 2% (瓦特/v) p甲醛, 在 RT 中增加2小时。 在 PBS (PBST) 中洗两次, 2 毫升0.1% 海卫 X-100。 在2毫升 0.05% TB 的水中孵育20分钟。 清洗几次 (至少3次) 与2毫升 pbs, 直到 pbs 解决方案清除是明确的。 在11、13、14的立体显微镜下, 通过目视检查分析样品。注: 结核表型与阴离子糖复合物在细胞外基质中的复合物, 如软骨 (PG) 和多糖 (插科打诨), 主要由软骨细胞样体细胞分泌。阳性样品被染成蓝色。 7. 西方污点 注: 本议定书中使用的程序以前在参考11中作了说明。 溶解 3 d-马国贤缓冲液中含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒的吹打。 根据凝胶体积要求 (特定凝胶运行设备) 制备丙烯酰胺凝胶, 并在 150 V16裂解物90分钟的电池。注: 丙烯酰胺凝胶通常是在 7.5–10% (w/v) 的浓度下制备的, 这取决于蛋白质的分子量。 将凝胶中的蛋白质转移到聚偏聚氟 (PVDF) 膜中, 在 RT 上应用 40 V 2 小时。 在一个单独的容器中, 用足够的容积覆盖膜, 在2小时的阻断缓冲器 (PBST 中的 4% (瓦特/v) 脱脂奶粉中) 孵化 PVDF 膜。 在 PBST 的最后浓度为1毫克/毫升时, 在 RT 中孵育1小时的膜。请参阅材料表。 添加二级抗体浓度为1毫克/毫升。请参阅材料表。 用化学发光基底16制备 hP 检测膜。请参阅材料表。 以化学发光图像16。