Aquí, presentamos un protocolo para obtener sistemas 3D-cultura en uno mismo-montaje de andamios péptido para promover la diferenciación de condrocitos articulares humanos dedifferentiated en tejido similar al cartílago.
Se describe una técnica útil para el cultivo de células en un uno mismo-montaje andamio nanofibras de (3D) tridimensional. Este sistema de cultivo recrea un entorno que imita muy de cerca las características estructurales del tejido no polarizado. Además, la estructura particular de nanofibras intrínseca del andamio es transparente a luz visible, que permite la fácil visualización de la muestra bajo microscopio. Esta ventaja en gran parte se utilizó para estudiar la migración de la célula, organización, proliferación y diferenciación y así cualquier desarrollo de su función celular mediante tinción con colorantes específicos o sondas. Además, en este trabajo, describimos el buen funcionamiento de este sistema para estudiar fácilmente la redifferentiation de condrocitos articulares humanos ampliado en tejido cartilaginoso. Las células fueron encapsuladas en uno mismo-montaje de andamios de péptido y cultivadas bajo condiciones específicas para promover la condrogénesis. Las culturas tridimensionales demostraron buena viabilidad durante las 4 semanas del experimento. Como era de esperar, las muestras cultivadas con inductores condrogénica (en comparación con controles no inducido) teñido fuertemente positivas para el azul de toluidina (que tiñe los glicosaminoglicanos (GAGs) que están muy presentes en la matriz extracelular del cartílago) y expresó los marcadores moleculares específicos, incluyendo colágeno tipo I, II y X, según análisis de Western Blot. Este protocolo es fácil de realizar y puede utilizarse en los laboratorios de investigación, industrias y propósitos educativos en los cursos de laboratorio.
Por muchas décadas, se ha realizado cultivo celular mamífero bajo condiciones experimentales utilizando sistemas de dos dimensiones clásicas de la cultura (2D) debido a problemas prácticos y económicos sin tener en cuenta los aspectos no-fisiológico. Aunque este sistema de cultivo ayuda a estudiar y comprender los mecanismos moleculares y celulares más, hoy sabemos que son necesarios nuevos paradigmas de la cultura de célula para el estudio de sistemas celulares más complejos. Por lo tanto, los sistemas de cultivo (3D) tridimensional son necesarios para recrear un microambiente que es basada, biomecánicamente y biológicamente más similar a la de los tejidos naturales. En los últimos años, los sistemas de cultivo 3D, en general, se han convertido en más frecuentes entre los investigadores y la industria puesto que representan un nuevo modelo de estudio o investigación en la que las células pueden crecer en el espacio, crean célula a célula o célula a matriz interacciones, migrar y Finalmente diferenciarse en linajes de células específicas.
El objetivo general de esta metodología es recrear una en vitro microambiente celular que está más cerca el microambiente en vivo . En particular, el andamio peptide uno mismo-montaje sintético (PAE) es un tipo de biomaterial con propiedades únicas; forma una red de poros de tamaño nanómetro hecha de interacciones débiles entre péptidos con propiedades mecánicas y estructurales similares de matrices extracelulares naturales. En otras palabras, la racionalidad detrás del uso de este material es que se crea un verdadero entorno en 3D que es ideal para obtener unidades de órganos o tejidos de pseudo-3D. Sin embargo, lo más importante, el contexto 3D permite la estructura 3D ganar nuevas funciones biológicas que normalmente no están presentes en las plataformas 2D de la cultura, tales como propiedades relacionadas con la arquitectura del tejido, fenómenos de transferencia de masa, patrón de la célula y eventualmente morfogénesis de tejidos, que son factores clave en futuras investigaciones y desarrollo de los tejidos funcionales y órganos1,2. Por otra parte, una ventaja de SAPS sobre sus contrapartes naturales (colágeno, Matrigel) es que son muy estables a temperatura ambiente y no requieren condiciones especiales de post producción, distribución o almacenamiento3,4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. programas de ajuste estructural es fácil de manejar, cuando se desee; Geles 3D pueden obtenerse simplemente aumentando la fuerza iónica o ajustando el pH a la neutralidad1,2. Finalmente, la metodología aquí descrita ha sido ampliamente utilizado en vitro para promover el mantenimiento, crecimiento y diferenciación de varios tipos celulares, incluyendo condrocitos, hepatocitos, células endoteliales, osteoblastos, células neuronales, así como las células madre embrionarias y somáticas3,4,5,6,7,8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14 , 15. en el presente trabajo, describimos el uso de un sistema de 3D-cultura humana condrocitos articulares Ampliadas (hACh) se diferencian en tejido similar al cartílago como se describió anteriormente11.
Aquí, se describe un método para células en cultivo en un sistema 3D usando programas de ajuste estructural. En este biomaterial sintético, las células se mezclan primero con una solución del péptido, que posteriormente se induce a la uno mismo-montar, crear una red de dimensiones nanométricas alrededor de las células y por lo tanto, crear un ambiente verdaderamente 3D (figura 1). Es importante considerar que el comportamiento celular está afectada por valores de rigidez de matriz (es decir, proliferación, migración y diferenciación). Por lo tanto, un control metodológico común es a células en cultivo en la parte superior del andamio del péptido con los mismos valores de rigidez (cultura en dos dimensiones).
Anteriormente, nuestro grupo y otros han descrito el uso de plataformas de la cultura (3D) tridimensional con célula diversos sistemas3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13,14,15. En el presente trabajo se describe un método sencillo y confiable de obtener cultura 3D sistemas que son aplicables a cualquier tipo de células de mamíferos incluyendo cualquier tipo de célula funcional, embrionaria o adulto células de vástago, o eventualmente, aislaron células disfuncionales de biopsias o tumores y así sucesivamente. Además, independientemente, si las células madre son de origen embrionario o adulto tendrían una mejor capacidad de compromiso de linaje en el entorno 3D que en 2D clásica de la cultura platos10,11,12, 13,14,15. Por lo tanto, el cultivo celular en este sistema daría lugar a la diferenciación en las estructuras como tejido funcionales que podrían ser utilizadas en diferentes aplicaciones, desde la biomedicina regenerativa o reparativa a plataformas toxicológicas y farmacológicas.
Hemos demostrado una ganancia clara en función de la célula porque el microambiente celular es similar a la de los tejidos naturales en cuanto a la estructura de la matriz y parámetros biomecánicos, biofísicos y biológicos. Sin embargo, como el sistema se vuelve más complejo, el número de parámetros que necesitan ser regulados también aumentos, que incluye la necesidad de una plataforma de apoyo externa (como un sistema de activa perfusión para evitar problemas asociados a fenómenos de transferencia de masa ). Las células cultivadas tridimensionalmente se desempeñan mejor en cuanto a la regulación de las actividades esenciales, como la migración, proliferación y diferenciación. Podrían formar redes complejas permitiendo mayor interferencia celular, que es en gran medida una consecuencia esencial de crecimiento y diferenciación en 3D. El hecho de que jugos podría crear condiciones en vitro similares a ésos matriz extracelular proteínas representa una ventaja desde un estudio racional del efecto producida por cada componente añadido al andamio (factor de crecimiento, polisacárido o señalización péptido) podría ser fácilmente realizado.
Las claras ventajas del uso de programas de ajuste estructural en comparación con otros andamios naturales, tales como colágeno tipo I y Matrigel, son los siguientes: 1) SAPS es un biomaterial sintético con mínima variación de lote a producción de hornada; 2) SAPS tiene la capacidad de ser funcionalizados con secuencias de péptidos específicos; y 3) presenta programas de ajuste estructural baja biodegradabilidad en vitro, que permite el mantenimiento de la construcción 3D con las mismas propiedades biofísicas, biomecánicas y estructurales en el tiempo. Sin embargo, la limitación del uso de jugos versus otros andamios se encuentra en la etapa de encapsulación, donde las células están en un ambiente hostil debido a bajo pH. Por lo tanto, este es un paso crítico en la metodología descrita. Por otra parte, es importante establecer la concentración de programas de ajuste estructural para cada tipo de célula específica antes de empezar cualquier experimento. Esto es, de hecho, esencial cuando las células se cultivan en o en estos biomateriales, ya que cada tipo de célula particular se presentan condiciones de crecimiento óptimo de biomecánica.
Por último, creemos que el diseño y la fabricación de este tipo de andamio de biomaterial mejoraría el desarrollo de modelos de tejido 3D más fisiológica y confiable para ayudar a la industria farmacéutica para desarrollar mejores enfoques terapéuticos para medicina regenerativa, cáncer o tratamiento médico.
The authors have nothing to disclose.
La investigación realizada por los autores fue apoyada en parte por subvenciones de la Unión Europea séptimo programa marco (FP7/2007-2013) bajo acuerdo de concesión no. 229239 y de la Fundación AO, exploratoria investigación colaborativa investigaciones programa aguda Cartílago daños/lesión, defecto (CRP ACI) bajo el proyecto Bioactive y biomiméticos andamios para regeneración de cartílago (BIOCART).
Human articular chondrocytes (Ach) | Lonza | CC-2550 | |
RAD16-I peptide solution (PuraMatrix) | Corning | 354250 | |
Sucrose (tissue culture grade) | Sigma | S0389 | |
Cell culture inserts (0.4 µm pore, 12 mm diameter) | Millipore | PICM01250 | |
Chondrocyte Basal Medium (CBM) | Lonza | CC-3217 | |
SingleQuots of Growth Supplements | Lonza | CC-4409 | |
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Lonza | DE14-801F | |
Dexamethasone | Sigma | D8893 | |
L-ascorbic acid 2-phosphate (AA2P) | Sigma | A8960 | |
Human transforming growth factor-β1 (TGF-β1) | Millipore | GF111 | |
RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Invitrogen | LC 2005 | |
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34080 | |
Anti-Actin | SCBT | sc-1615 | |
Anti-Collagen I | Abcam | ab138492 | |
Anti-Collagen II | Abcam | ab3092 | |
Anti-Collagen X | Abcam | ab182563 | |
Antigoat IgG-HRP | Abcam | ab97100 | |
Anti-mouse IgG-HRP | Abcam | ab97023 | |
Anti-rabbit IgG-HRP | Abcam | ab97051 |