نقدم هنا، وضع بروتوكول للحصول على نظم 3D-الثقافة في تجميع السقالات الببتيد لتعزيز التفريق بين ديديفيرينتياتيد chondrocytes مفصلي البشرية في الأنسجة مثل الغضاريف الذاتية.
ويرد وصف تقنية مفيدة لاستزراع الخلايا في سقالة نانوفيبير ثلاثية الأبعاد (3D) تجميع ذاتي. يجسد هذا النظام ثقافة بيئة الذي يحاكي عن كثب السمات الهيكلية للأنسجة غير الاستقطاب. وعلاوة على ذلك، هيكل السقالة nanofiber المضمنة معين يجعل من شفافة للضوء المرئي، مما يسمح للتصور سهلة للعينة تحت المجهر. واستخدمت هذه الميزة إلى حد كبير لدراسة الهجرة الخلية والمنظمة، والانتشار، والتمايز وهكذا أي تطوير وظيفتها الخلوية خاصة بالتلوين بالأصباغ محددة أو تحقيقات. وعلاوة على ذلك، يصف لنا في هذا العمل، والأداء الجيد لهذا النظام لدراسة ريديفيرينتييشن لتوسيع chondrocytes مفصلي البشرية بسهولة في الأنسجة عنقية. الخلايا مغلفة في تجميع ذاتي الببتيد السقالات ومثقف تحت شروط معينة لتعزيز تشوندروجينيسيس. الثقافات ثلاثي الأبعاد وأظهرت جدوى جيدة خلال 4 أسابيع التجربة. كما هو متوقع، عينات مثقف مع الحمام تشوندروجينيك (بالمقارنة مع المستحثة بغير ضوابط) الملون بقوة إيجابية لازرق تولويدين (الذي البقع الجليكوزامينوجليكان (الكمامات) العالية الموجودة في المصفوفة خارج الخلية الغضاريف)، وأعرب عن اكتب علامات جزيئية محددة، بما في ذلك الكولاجين الأول والثاني والعاشر، وفقا لتحليل “لطخة الغربية”. هذا البروتوكول سهلة لأداء، ويمكن استخدامها في المختبرات البحثية والصناعات والأغراض التعليمية في الدورات المختبرية.
وقد أجريت لعقود عديدة، ثقافة خلية الثدييات تحت ظروف تجريبية باستخدام أنظمة الثقافة (2D) ثنائية الأبعاد الكلاسيكية بسبب المسائل العملية والاقتصادية بغض النظر عن الجوانب غير الفسيولوجية. على الرغم من أن هذا النظام الثقافي يساعد على دراسة وفهم أكثر الآليات الجزيئية والخلوية، ونحن نعلم اليوم أن نماذج الثقافة خلية جديدة ضرورية لدراسة النظم الخلوية أكثر تعقيداً. ولذلك، نظم الثقافة (3D) ثلاثي الأبعاد تحتاج إلى إعادة إنشاء المكروية التي بيوفيسيكالي، بيوميتشانيكالي، وبيولوجيا أكثر مماثلة للأنسجة الطبيعية. في السنوات الأخيرة، نظم الثقافة 3D، بشكل عام، أصبحت أكثر انتشارا بين الباحثين والصناعة نظراً لأنها تمثل نموذجا جديداً لدراسة أو فحص في الخلايا التي يمكن أن تنمو في الفضاء، وإنشاء خلية إلى خلية أو خلية لمصفوفة التفاعلات، تهاجر و في نهاية المطاف تفرق في الأنساب الخلية المحددة.
والهدف العام لهذه المنهجية هو إعادة في المختبر خلوية المكروية التي أقرب إلى المكروية في فيفو . على وجه الخصوص، سقالة الببتيد تجميع ذاتي الاصطناعية (برامج التكيف الهيكلي) نوع من مادة بيولوجية مع خصائص فريدة من نوعها؛ وهي تشكل شبكة مسام نانومتر الحجم مصنوعة من التفاعلات الضعيفة بين الببتيدات مع الخصائص الميكانيكية والهيكلية مماثلة تلك المصفوفات خارج الخلية الطبيعية. وبعبارة أخرى، العقلانية وراء استخدام هذه المواد فإنه ينشئ حقاً 3D-بيئة التي مثالية للحصول على أنسجة الزائفة-3D أو وحدات الجهاز. ولكن الأهم من ذلك، يسمح سياق 3D هيكل ثلاثي الأبعاد للحصول على الوظائف البيولوجية الجديدة التي عادة ليست موجودة في 2D ثقافة المنابر، مثل خصائص تتعلق بهندسة الأنسجة، ظواهر النقل الجماعي، خلية الزخرفة، وفي نهاية المطاف morphogenesis الأنسجة، وعوامل رئيسية في المستقبل للبحث وتطوير وظيفي أنسجة وأجهزة1،2. وعلاوة على ذلك، ميزة لبرامج التكيف الهيكلي على نظيراتها الطبيعية (الكولاجين، ماتريجيل) هو أنها مستقرة جداً في درجة حرارة الغرفة ولا تتطلب شروطا خاصة لمرحلة ما بعد الإنتاج أو التوزيع أو مخزن3،4، 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15-برامج التكيف الهيكلي من السهل التعامل معها، عندما رغبت؛ المواد الهلامية 3D يمكن الحصول عليها ببساطة بزيادة قوام القوة الأيونية أو بتعديل درجة الحموضة إلى الحياد1،2. أخيرا، كانت المنهجية الموصوفة هنا المستخدمة على نطاق واسع في المختبر لتعزيز الصيانة والنمو والتمايز على عدد من أنواع الخلايا، بما في ذلك تشوندروسيتيس، خلايا الكبد، وخلايا بطانية، وخلايا الاوستيوبلاستس، الخلايا العصبية، وكذلك كالخلايا الجذعية الجنينية وجسدية3،4،5،،من67،،من89،10، 11 , 12 , 13 , 14 , 15-في العمل الحالي، يمكننا وصف استخدام نظام 3D-الثقافة للتفرقة بين البشر chondrocytes مفصلي الموسعة (هاتش) في الأنسجة مثل الغضاريف كما هو موضح سابقا11.
هنا، يتم وصف طريقة لخلايا الثقافة في نظام ثلاثي الأبعاد باستخدام برامج التكيف الهيكلي. في هذا مادة بيولوجية الاصطناعية، خلايا تختلط أولاً بحل ببتيد، الذي فعل في وقت لاحق لتجميع ذاتي، إنشاء شبكة أبعاد النانومترية حول الخلايا وذلك خلق بيئة 3D حقاً (الشكل 1). من المهم أن تنظر في أن السلوك الخلوي يتأثر بصلابة مصفوفة القيم (أي انتشار، والهجرة والتمييز). ولذلك، عنصر تحكم منهجية مشتركة لخلايا الثقافة فوق سقالة الببتيد بنفس صلابة قيم (الثقافة في بعدين).
سابقا، وصف مجموعتنا، والبعض الآخر استخدام منصات الثقافة (3D) ثلاثي الأبعاد مع الخلية متنوعة النظم3،4،5،،من67،8 ،9،10،11،،من1213،،من1415. في هذا العمل، ونحن تصف طريقة سهلة ويمكن الاعتماد عليها للحصول على الثقافة 3D الخلايا الجذعية النظم التي يمكن تطبيقها على أي نوع من خلايا الثدييات بما في ذلك أي نوع من الخلايا الوظيفية، الجنينية أو الكبار، أو في نهاية المطاف، عزل خلايا مختلة من الخزعات أو الأورام، وهلم جرا. وبالإضافة إلى ذلك، بشكل مستقل، إذا كانت الخلايا الجذعية المنشأ الجنينية أو الكبار أن لديهم قدرة التزام نسب أفضل في بيئة ثلاثية الأبعاد من الثقافة 2D الكلاسيكية الأطباق10،،من1112، 13،،من1415. ولذلك، ثقافة الخلية في هذا النظام سيؤدي إلى التمايز في هياكل مثل الأنسجة الوظيفية التي يمكن أن تستخدم في تطبيقات مختلفة، من الطب الترميمي أو التجدد الحيوي لمنصات السمية والدوائية.
وقد أظهرنا مكسب واضح في وظيفة الخلية لأنه يشبه المكروية الخلوية للأنسجة الطبيعية من حيث هيكل المصفوفة ومعلمات النشاط الحيوي والفيزيائية والبيولوجية. ومع ذلك، كما يصبح النظام أكثر تعقيداً، عدد المعلمات التي يجب أن تكون ينظم أيضا الزيادات، التي تشمل الحاجة إلى منصة دعم خارجي (مثل نظام التروية نشطة لتجنب النقل الجماعي للقضايا المرتبطة بالظواهر ). الخلايا المزروعة ثريديمينسيونالي أداء أفضل فيما يتعلق بتنظيم الأنشطة الأساسية، مثل الهجرة والانتشار والتفرقة. أنها يمكن أن تشكل الشبكات المعقدة مما يتيح تعزيز الحديث المتبادل الخلوية، الذي إلى حد بعيد كنتيجة أساسية لتنمو والتفريق في 3D. حقيقة أن يستنزف يمكن أن تخلق الظروف في المختبر مشابهة لتلك تمثل البروتينات المصفوفة خارج الخلية تنتج ميزة منذ دراسة عقلانية للتأثير لكل مكون من مكونات إضافة إلى السقالة (عامل النمو أو السكاريد أو إشارات يمكن أن يقوم الببتيد) بسهولة.
المزايا الواضحة لاستخدام برامج التكيف الهيكلي بالمقارنة إلى السقالات الطبيعية الأخرى، مثل الكولاجين النوع الأول وماتريجيل، هي ما يلي: 1) برامج التكيف الهيكلي مادة بيولوجية اصطناعية مع اختلاف الحد الأدنى من دفعة إلى دفعة الإنتاج؛ 2) برامج التكيف الهيكلي لديها القدرة على أن تكون فونكتيوناليزيد بزخارف الببتيد محددة؛ و 3) يعرض برامج التكيف الهيكلي انخفاض تحلل الأحيائي في المختبر، مما يسمح بالحفاظ على بنية ثلاثية الأبعاد مع نفس الخصائص الفيزيائية-الحيوية والنشاط الحيوي والهيكلية على مر الزمن. ومع ذلك، الحد من استخدام يستنزف مقابل أخرى يتم العثور على السقالات أثناء الخطوة التغليف، حيث تكون الخلايا في بيئة عدائية بسبب انخفاض درجة الحموضة. ولذلك، هذا خطوة حاسمة في وصف المنهجية. وعلاوة على ذلك، من المهم تعيين تركيز برامج التكيف الهيكلي لكل نوع خلية معينة قبل البدء في أي تجربة. وهذا ضروري، في الواقع، عندما تستزرع خلايا على أو إلى هذه الحيوية، حيث سيقدم كل نوع خلية معينة ظروف نمو النشاط الحيوي الأمثل.
وأخيراً، نعتقد أن تصميم وتصنيع هذا النوع من مادة بيولوجية سقالة سيعزز تطوير نماذج الأنسجة ثلاثية الأبعاد الفسيولوجية وأكثر اعتمادية لمساعدة صناعة المستحضرات الصيدلانية لتطوير أفضل النهج العلاجي الطب التجديدي أو السرطان أو أي علاج طبي.
The authors have nothing to disclose.
البحوث التي يقوم بها أصحاب تدعمها جزئيا منح من “الاتحاد الأوروبي البرنامج الإطاري السابع” (FP7-2007-2013) ضمن اتفاق المنحة رقم 229239، ومن “مؤسسة AO الاستكشافية البحوث التعاونية أبحاث البرنامج الحادة” غضروف الإصابة/الآفة/عيب (المجلس الدولي للمطارات CRP) في إطار مشروع بيواكتيفي والسقالات المحاكاة البيولوجية لتجديد الغضاريف (بيوكارت).
Human articular chondrocytes (Ach) | Lonza | CC-2550 | |
RAD16-I peptide solution (PuraMatrix) | Corning | 354250 | |
Sucrose (tissue culture grade) | Sigma | S0389 | |
Cell culture inserts (0.4 µm pore, 12 mm diameter) | Millipore | PICM01250 | |
Chondrocyte Basal Medium (CBM) | Lonza | CC-3217 | |
SingleQuots of Growth Supplements | Lonza | CC-4409 | |
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Lonza | DE14-801F | |
Dexamethasone | Sigma | D8893 | |
L-ascorbic acid 2-phosphate (AA2P) | Sigma | A8960 | |
Human transforming growth factor-β1 (TGF-β1) | Millipore | GF111 | |
RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Invitrogen | LC 2005 | |
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34080 | |
Anti-Actin | SCBT | sc-1615 | |
Anti-Collagen I | Abcam | ab138492 | |
Anti-Collagen II | Abcam | ab3092 | |
Anti-Collagen X | Abcam | ab182563 | |
Antigoat IgG-HRP | Abcam | ab97100 | |
Anti-mouse IgG-HRP | Abcam | ab97023 | |
Anti-rabbit IgG-HRP | Abcam | ab97051 |