Summary

Eine Methode zur Messung der Speicheldrüse Funktion bei Mäusen

Published: January 25, 2018
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Summary

Speicheldrüse Unterfunktion ist eine häufige Folge von Autoimmun-Krankheit und Strahlentherapie. Reproduzierbare Beurteilung der Speicheldrüse Funktion in Mausmodellen dieser Krankheiten ist eine technische Herausforderung. Hier ist eine einfache Methode für die genaue und reproduzierbare Messung der Speichelproduktion bei Mäusen beschrieben.

Abstract

Patienten mit Sjögren Syndrom, eine Autoimmunerkrankung, die Auswirkungen auf die therapeutisches Drüsen, Entzündung der Speicheldrüse zu entwickeln und Speichelproduktion reduziert haben. Ebenso ist Speichelproduktion bei Patienten, die Strahlentherapie bei Kopf-Hals-Tumoren stark beeinträchtigt. Nager-Modelle entwickelt, um diese Krankheitsbilder imitieren ein Verständnis der Pathogenese der Krankheit erleichtern und die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien ermöglichen. Daher ist die Fähigkeit, präzise, reproduzierbar und wiederholt Speicheldrüse Funktion in Tiermodellen messen entscheidend. Aufbauend auf den bisher in der Literatur beschriebenen Verfahren, wurde eine Methode entwickelt, die diese Kriterien erfüllt und wurde verwendet, um die Speicheldrüse Funktion bei Mäusen zu bewerten. Ein weiterer Vorteil dieser neuen Methode ist, dass es problemlos gemeistert und wenig Inter-Operator-Variation hat. Speicheldrüse Funktion wird als die Menge (Gewicht oder Volumen) oder die Rate (mL/min) in Reaktion auf die Pilocarpin Stimulation produziert Speichel ausgewertet. Die gesammelten Speichel ist eine gute Quelle für die Analysen der Eiweißgehalt, Immunglobulin-Konzentrationen und andere Biomoleküle.

Introduction

Die Speicheldrüsen produzieren Speichel in Reaktion auf eine Vielzahl von neurologischen und mechanische Reize1. Die Reize werden durch die sympathischen und parasympathischen Nervensystem an die adrenergen und cholinergen Rezeptoren in der Drüse durchgeführt. Pilocarpin ist ein cholinergen, Para-Sympathomimetikum, das überwiegend auf Muskarin-Rezeptoren wirkt. In der Speicheldrüse induziert es die Produktion von Speichel durch Einwirkung auf die Muskarin Acetylcholin-Rezeptor M31. Speichelproduktion nach Pilocarpin Gabe ist ein Indikator für die Fähigkeit der Speicheldrüsen, auf Reize reagieren und wird allgemein als ein Maß für die Speicheldrüse Funktion verwendet.

Genaue Messung der Speichelproduktion ist entscheidend für das Studium der Speicheldrüse Krankheiten einschließlich Sjögren Syndrom2 und Strahlung Verletzung nach Kopf und Nacken Krebs Behandlung3. Verschiedene Methoden wurden entwickelt, um die Speichelproduktion bei Nagetieren zu messen. Dazu gehören direkte Kanülierung der Speicheldrüsen Ausführungsgang4, die Sammlung von Speichel aus der Mundhöhle unter Vakuum5und Inkasso mit Glas Kapillaren6 oder einer Mikropipette7,8, 9. direkte Kanülierung der Speicheldrüsen Rohrleitung bietet am meisten präzise und reine Speichel. Aber dies ist eine technisch anspruchsvolle Verfahren und das Potenzial für Umstehende Duktales schließt sich wiederholende Speichel Sammlungen vom selben Tier. Sammeln von Speichel unter Vakuum führen zu unterschiedliche Ergebnisse durch Trocknung des Speichels aus dem Rohr. Dieser Verlust ist bei Mäusen mit reduzierter Speichelfluss weiter übertrieben. Glaskapillaren erlauben die Sammlung des Speichels für spätere Analysen, Veränderungen in der Viskosität des Speichels abgesondert im kranken Zustand verhindert jedoch, dass effiziente Füllung der Kapillare. Darüber hinaus können Versuche die Mundhöhle residual Speichel sammeln zu fegen zu Verletzungen führen. Pipettieren Methode ermöglicht die komplette Sammlung, und für den gleichen Betreiber ist es bemerkenswert konsistent zwischen Experimente. Aus unbekannten Gründen zeigt diese Methode jedoch erhebliche Unterschiede zwischen verschiedenen Betreibern. Daher um entsprechende Vergleiche zu ermöglichen, ist es zwingend notwendig, dass die gleiche Betreiber alle Experimente, die im Zusammenhang mit einem bestimmten Projekt führt. Natürlich ist dies einen großen Nachteil für ein Labor.

Um diese Probleme zu überwinden, wurde ein Verfahren entwickelt, dass verbindet Speichel Erhebungsmethoden für Menschen und Nagern verwendet. Die unten beschriebene, für Pilocarpin induzierten Speichel Messvolumen Tupfer-Methode ist einfach, reproduzierbar und nicht beeinflusst durch den Betreiber und immer wieder in das gleiche Tier durchgeführt werden kann. Darüber hinaus ermöglicht es den Speichel für spätere Analysen von Proteinen, Immunglobuline oder andere Biomoleküle zu sammeln.

Protocol

Die nachfolgend beschriebene Protokoll von institutionellen Animal Care und Use Committee genehmigt wurde und es folgt die ethischen Leitlinien durch die National Institutes of Health. Alle Daten, die in diesem Bericht vorgestellten entstanden mithilfe von weiblichen Mäusen, die 10-12 Wochen alt waren. Die folgenden Stämme von Mäusen wurden verwendet: C57BL/6, BALB/c, DBA1, 129S und F1 (B6XA/J). Alle Mäuse waren in Barriere Käfigen (5 Tiere pro Käfig) in bestimmten Pathogen-freies Bedingungen untergebracht und Futt…

Representative Results

In der experimentellen Maus-Modellsystemen ist die Fähigkeit, Speichel in Reaktion auf die Pilocarpin Stimulation produzieren als Indikator der Speicheldrüse Funktion verwendet. Speichelproduktion wurde in 11 Wochen alten C57BL/6 weiblichen Mäusen durch die Tupfer-Methode gemessen. Die Ergebnisse sind in Abbildung 1Aals die Menge des Speichels (mg) gesammelten nach zunehmenden Dosen von Pilocarpin ausgedrückt. Bei der Dosis von 1 mg/kg Körpergewicht bega…

Discussion

Speichelproduktion ist ein komplexer Prozess und wird durch viele Faktoren beeinflusst. Daher kann die Messfunktion Speicheldrüse bei Versuchstieren eine Herausforderung sein. Eine zusätzliche Herausforderung ist, dass wiederholte Messungen der Speicheldrüse Funktion im gleichen Tier erforderlich, um den Ausbruch der Krankheit zu etablieren oder zur Erholung nach der Behandlung zeigen.

In diesem Bericht beschriebenen Tupfer-Methode ist technisch einfach mit mehreren Optionen zur Darstellung…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Studie wurde unterstützt durch ein Stipendium der National Institutes of Health, National Institut of Dental und Craniofacial Forschung (DE025030).

Materials

Chemicals for saliva collection
Pilocarpine hydrochloride Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA B21410 Dilute in sterile isotonic saline. Store single use aliquots of 100X stock at -80oC
Name Company Catalog Number Comments
Anesthesia Mix solution Mix 1 mL ketamine hydrochloride + 0.5 mL xylazine + 8.5 mL sterile isotonic saline in a sterile vial. Can be used for 3 months.
Zetamine (Ketamine hydrochloride) Vet One, Boise, Idaho, USA C3N VT1 Stock is 100 mg/mL
Anased (Xylazine) Med-Vet International, Mettawa, IL, USA RXANASED-20 Stock is 20 mg/mL
Isotonic sterile saline Vet One, Boise, Idaho, USA 501032 Used as diluent
Artificial tears (lubricant ophthalmic ointment) Henry Schien, Dublin, OH, USA 48272 Used to prevent eyes from drying during the procedure
Name Company Catalog Number Comments
Materials for saliva collection
SalivaBio Children's swab Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, USA N/A Individually wrapped swabs
50 mL polypropylene tubes VWR, Radnor, PA, USA 89004-364 Cut off the bottom 1 cm of the tube. Make sure that the cut edge is smooth.
Microcentrifuge tubes 0.6 mL VWR, Radnor, PA, USA 87003-290 Make holes in the bottom of tube with heated 18 gauge needles
Microcentrifuge tubes 2 mL VWR, Radnor, PA, USA 87003-298
Insulin Syringes with permanently attached needles Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA 324702
18 gauge regular bevel needles Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA 305195
Sterile scalpel blade #11 Integra York Inc PA, USA 4-311
Microdissecting forceps Roboz, Gaithersburg, MD, USA RS-5139 Serrated angular 0.8 mm tip, 4" length
Label tape Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA sc-224487
3 channel timer Amazon.com, Seattle, WA, USA B06W2KCYVN
Analytical Balance Mettler Toledo, Columbus OH, USA
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals/ reagents for inducing salivary dysfunction
LPS Invivogen, San Deigo, CA, USA tlrl-b5lps Dissolve in endotoxin free water, and store stock solution at 5 mg/mL . dilute in sterile HBSS 100 ug/mL – inject 100 uL/ moue ip
Imject Alum adjuvant Thermo Scientific 77161 Dilute 1:1 in sterile saline. Inject intraperitoneally 0.1 mL/mouse
Rabbit anti-Ro52 antiserum Generated in lab Immunization of rabbits with recombinant mouse Ro52
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals/ Kits for saliva analyses
Salivary lysozyme estimation
EnzChek Lysozyme Assay Kit Molecular Probes, Eugene, OR, USA E-22013 Used as per manufacturer's instructions
Name Company Catalog Number Comments
Salivary IgA estimation by sandwich ELISA
Mouse IgA Southern Biotech, Birmingham, AL, USA 0106-01 Standards for sandwich ELISA – range 30 ng/mL to 0.5 ng/mL
Goat anti- mouse IgA unlabeled Southern Biotech, Birmingham, AL, USA 1040-01 Coat at 1 ug/mL in bicarbonate buffer
Goat anti- mouse IgA HRP Southern Biotech, Birmingham, AL, USA 1040-05 Detection antibody used at 1:4000 dilution
TMB substrate Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA 555214 Used as per manufacturer's instructions
Immulon 4HBX Microtiter 96 well plates Thermo Scientific, Rochester, NY, USA 3855
Name Company Catalog Number Comments
Salivary protein estimation
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate BioRad, Hercules, CA, USA 5000006 For protein estimation as per manufacturer's instructions

Referenzen

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Diesen Artikel zitieren
Bagavant, H., Trzeciak, M., Papinska, J., Biswas, I., Dunkleberger, M. L., Sosnowska, A., Deshmukh, U. S. A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice. J. Vis. Exp. (131), e57203, doi:10.3791/57203 (2018).

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