Romanen passiv Clearing metoder för snabb produktion av optisk transparens i hela CNS-vävnaden
Summary
Här presenterar vi två nya metoder, psPACT och mPACT, för att uppnå maximal optisk transparens och efterföljande Mikroskopisk analys av vävnad kärlsystemet i intakt gnagare hela CNS.
Abstract
Sedan utvecklingen av klarhet, en bioelectrochemical clearing teknik som möjliggör tredimensionella fenotyp kartläggning inom genomskinliga vävnader, en mängd roman clearing metoder inklusive CUBIC (klar, fri hjärnavbildning cocktails och computational analys), strömbrytare (systemomfattande kontroll av interaktion tid) och kinetik av kemikalier, karta (förstorade analys av proteomet) och pakten (passiv tydlighet teknik), har fastställts att ytterligare utvidga den befintliga toolkit för Mikroskopisk analys av biologisk vävnad. Den föreliggande studie syften till att förbättra och optimera ursprungliga pakt förfarandet för en rad intakt gnagare vävnader, inklusive hela centrala nervsystemet (CNS), njurar, mjälte och hela musembryon. Kallas psPACT (process-avskilj PACT) och mPACT (modifierad PACT), ger dessa nya tekniker mycket effektiv medel av kartläggning cell kretsar och visualisera subcellulära strukturer i intakt normal och patologisk vävnad. I följande protokoll ger vi en detaljerad, steg för steg beskrivning om hur man uppnår maximal vävnad clearance med minimal invasion av deras strukturella integritet via psPACT och mPACT.
Introduction
Ett grundläggande mål för vetenskaplig och klinisk undersökning innebär att uppnå en fullständig förståelse av orgel struktur och funktion; dock fungerar ytterst komplexa karaktär av däggdjur organ ofta som en barriär till fullo uppnå detta mål1. KLARHET (tydlig Lipid-utbyts akrylamid-hybridiserad styv Imaging-kompatibel Tisssue-hYdrogel)2,3,4, vilket innebär att bygga en akrylamid-baserade hydrogel hybrid från intakta vävnader, uppnår optiska clearance av en mängd organ, inklusive hjärnan, lever och mjälte, samtidigt som deras strukturella integritet5. TYDLIGHET har därmed möjliggjort inte bara visualisering, men också möjlighet att fint dissekera komplexa mobilnät och vävnad morfologier utan behov för snittning.
För att uppnå vävnad clearance, sysselsätter tydlighet kapillärelektroforetiska metoder att ta bort fettinnehållet av provet till hands. Medan tydlighet har noterats för att producera fysiskt stabil vävnad-hydrogel hybrider, studier har visat att dess användning av elektroforetiska vävnad röjningmetoder (ETC) ger varierande resultat kvalitativt vävnad, inklusive browning, epitop skada, och protein förlust5,6. För att lösa dessa frågor, varit modifierade protokoll såsom pakten (passiv tydlighet teknik), som ersätter ETC behandling med en passiv, ionic-tvättmedel baserat delipidation teknik, utvecklade7,8,9. Trots en större samstämmighet i resultaten, men kräver pakten mer tid för att få maximal clearance. Ingen av dessa tekniker har dessutom ännu tillämpats i hela CNS-formuläret, eller i större gnagare modeller såsom råttor och marsvin.
Föreliggande studie syftar till att hantera dessa begränsningar genom att föreslå nya metoder, psPACT (process-avskilj PACT) och mPACT (modifierad PACT), för att underlätta snabb clearance av hela CNS och inre organ i både mus och råtta modellerna10. Specifikt, psPACT bearbetar vävnader i 4% akrylamid och 0,25% VA-044 i två separata steg under hydrogel bildande; mPACT i huvudsak omfattar samma steg, men kompletterar SDS-baserade clearing lösningen med 0,5% α-thioglycerol som en nyckel reagens. Båda teknikerna utnyttja de endogena systemisk och ryggmärgsvätskan cirkulationssystem för att avsevärt minska den tid som behövs för att producera optiska clearance. Som ett bevis på princip demonstrera vi användningen av konfokalmikroskopi att analysera blodkärl mönster i clearade vävnader10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Medan passiv, icke-elektrofores extraktionsmetoder anställd i bättre pakten betydligt enhetlighet uppnås med tidigare vävnad clearing metoder såsom klarhet2,3,4,7 , 8, tekniken bär fortfarande flera brister, de mest akuta som är tidsperiod som krävs för att uppnå maximal vävnad tydlighet12. I den aktuella studien presenterar …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av projektet hjärnan Korea 21 PLUS för medicinsk vetenskap, Yonsei University. Dessutom var detta arbete stöds av ett bidrag från den National Research Foundation of Korea (NRF-2017R1D1A1B03030315).
Materials
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Affymetrix, Inc. | 75819 | Clearing solution |
| Nycodenz | Axia-Shield | 1002424 | nRIMS solution |
| 40% Acrylamide Solution | Bio Rad Laboratories, Inc. | 161-0140 | Polymerization (A4P0) |
| 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] Dihydrochloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 017-19362 | Polymerization (VA-044) |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M1753-100ML | Clearing solution (mPACT) |
| Tween-20 | Georgiachem | 9005-64-5 | nRIMS solution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | Immuno Staining |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bovogen | BSA100 | Immuno Staining |
| Heparin | Merck Millipore | 375095 | Perfusion (PBS) |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-25G | nRIMS solution |
| PECAM-CD31 antibody | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-28188 | Immuno Staining |
| Goat anti-rabbit-IgG Cy3 fluorescent conjugate | Jackson ImmunoResearch Inc. | 111-165-003 | Immuno Staining |
| 4% Paraformaldehyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | Perfusion, Polymerization |
| 20X Phosphate Buffered Saline (pH 7.4) | Tech & Innovation | BPB-9121 | Perfusion, Buffer |
| 10 mL stripette | Coatar | 4488 | Solution transfer |
| 50 mL tube | Falcon | 352070 | Clearing tube |
| 35 mm Cell culture dish | SPL | 20035 | Imaging |
| Confocal dish | SPL | 211350 | Imaging |
| 1 mL syringe | Korea vaccine Co., Ltd | 26G 1/2 | Anesthetize |
| 50 mL syringe | Korea vaccine Co., Ltd | 21G1 1/4 | Perfusion |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A3553 | Polymerization (A4P0) |
| Whatman 3MM paper | Sigma-Aldrich | Z270849 | Blotting paper for gel removal |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM780 | Imaging |
| ZEN lite Software | Zeiss | ZEN 2012 | Imaging |
| Peristaltic pump | Longerpump | BT100-1F | Perfusion |
| EasyGel | Lifecanvas Technologies | EasyGel | Tissue gel hybridization system |
Referenzen
- Zhu, X., Xia, Y., Wang, X., Si, K., Gong, W. Optical brain imaging: A powerful tool for neuroscience. Neurosci Bull. 33 (1), 95-102 (2017).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Sci Rep. 7, 44810 (2017).
- Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Dev Biol. 14, 48 (2014).
- Jensen, K. H. R., Berg, R. W. Advances and perspectives in tissue clearing using CLARITY. J Chem Neuroanat. 86, 19-34 (2017).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nat Protoc. 10 (11), 1860-1896 (2015).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Sci Rep. 6, 34331 (2016).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Exp Mol Med. 48 (12), 274 (2016).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY. J Vis Exp. (112), (2016).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: A simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Choi, B. R., et al. Increased expression of the receptor for advanced glycation end products in neurons and astrocytes in a triple transgenic mouse model of Alzheimer’s disease. Exp Mol Med. 46, 75 (2014).
- Chang, D. J., et al. Contralaterally transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor cells (ENStem-A) migrate and improve brain functions in stroke-damaged rats. Exp Mol Med. 45, 53 (2013).
- Kim, T. K., et al. Analysis of differential plaque depositions in the brains of Tg2576 and Tg-APPswe/PS1dE9 transgenic mouse models of Alzheimer disease. Exp Mol Med. 44 (8), 492-502 (2012).
- Kinameri, E., et al. Prdm proto-oncogene transcription factor family expression and interaction with the Notch-Hes pathway in mouse neurogenesis. PLoS One. 3 (12), e3859 (2008).
