Nuevo pasivo claro los métodos para la producción rápida de transparencia óptica en todo el tejido del SNC
Summary
Aquí, presentamos dos metodologías novedosas, psPACT y mPACT, para lograr la máxima transparencia óptica y posterior análisis microscópico de vascularización del tejido en el roedor intacto todo CNS.
Abstract
Desde el desarrollo de la claridad, un bioelectroquímicos limpieza técnica permite mapeo tridimensional fenotipo dentro de tejidos transparentes, una multitud de metodologías de novela claro incluyendo cúbicos (proyección de imagen de cerebro claro y sin obstrucciones cócteles y análisis computacional), interruptor (todo el sistema de control de tiempo de interacción) y la cinética de los productos químicos, mapa (ampliada análisis del proteoma), Pacto (técnica de claridad pasivo), se han establecido para ampliar las herramientas existentes para el análisis microscópico de tejidos biológicos. El presente estudio pretende mejorar y optimizar el procedimiento de Pacto original para una gran variedad de tejidos de roedores intactos, incluyendo el todo sistema nervioso central (CNS), riñones, bazo y embriones de ratón todo. Denominado psPACT (Pacto de proceso separado) y mPACT (Pacto modificado), estas nuevas técnicas proporcionan medios altamente eficaces de asignación de circuitos de células y visualizar estructuras subcelulares en los tejidos normales y patológicos intactos. En el siguiente protocolo, proporciona un contorno detallado, paso a paso cómo lograr separación máxima del tejido con mínima invasión de su integridad estructural a través de psPACT y mPACT.
Introduction
Un objetivo fundamental de la investigación científica y clínica consiste en lograr una comprensión completa de la estructura de órgano y función; sin embargo, la naturaleza extremadamente compleja de órganos mamíferos a menudo sirve como una barrera para alcanzar plenamente este objetivo1. CLARIDAD (intercambian lípidos claro cruzado por hibridación acrilamida rígido compatible con la proyección de imagen Tisssue-hidrogel)2,3,4, que implica la construcción de un híbrido basados en acrilamida hidrogel de tejidos intactos, logra separación óptica de una variedad de órganos, incluyendo el cerebro, el hígado y el bazo, mientras que preserva su integridad estructural5. CLARIDAD así ha permitido no sólo la visualización, sino también la oportunidad de disecar finamente complejas redes celulares y morfologías de tejido sin necesidad de seccionar.
Para lograr la separación de tejido, claridad emplea métodos electroforéticos para eliminar el contenido de lípidos de la muestra de mano. Mientras que la claridad se ha observado para producir híbridos de tejido-hidrogel físicamente estable, los estudios han demostrado que el uso de métodos de electroforesis tejido claro (ETC) produce resultados variables en cuanto a la calidad del tejido, incluyendo dorado, daño del epítopo, y pérdida de proteína de5,6. Para tratar estos temas, protocolos modificados como Pacto (pasivo claridad técnica), que sustituye el tratamiento etc. con una técnica pasiva, detergente iónico delipidation basado, han sido desarrollados7,8,9. A pesar de lograr una mayor consistencia en los resultados, sin embargo, pacto requiere más tiempo para obtener la máxima separación. Además, ninguna de estas técnicas todavía se aplicaron a la forma entera de la CNS, o en modelos más grandes roedores como las ratas y conejillos de Indias.
El presente estudio pretende abordar estas limitaciones proponiendo metodologías novela, psPACT (Pacto de proceso separado) y mPACT (Pacto modificado), para facilitar la rápida liquidación de CNS todo los órganos internos en modelos de ratón y rata10. Específicamente, psPACT procesos de tejidos en acrilamida 4% y 0.25% VA-044 en dos pasos separados durante la formación del hidrogel; mPACT esencialmente implica los mismos pasos, pero complementa la solución claro basado en SDS 0,5% α-thioglycerol como un reactivo clave. Ambas técnicas aprovechan la endógena sistémica y cerebroespinal circulatorio para reducir significativamente el tiempo necesario para producir la separación óptica. Como una prueba de principio, nos demuestran el uso de la microscopia confocal para analizar patrones de vasos sanguíneos en los tejidos despejado10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mientras que los métodos de extracción pasiva, no electroforéticas emplean en pacto mejoró significativamente la consistencia alcanzada con tejido anterior claro métodos tales como la claridad2,3,4,7 , 8, la técnica aún tiene varios defectos, el más acuciante de que es la longitud de tiempo requerido para lograr el máximo tejido claridad<sup class="xr…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el proyecto cerebro Corea 21 PLUS para ciencias médicas, Universidad de Yonsei. Además, este trabajo fue apoyado por una beca de la Fundación Nacional de investigación de Corea (NRF-2017R1D1A1B03030315).
Materials
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Affymetrix, Inc. | 75819 | Clearing solution |
| Nycodenz | Axia-Shield | 1002424 | nRIMS solution |
| 40% Acrylamide Solution | Bio Rad Laboratories, Inc. | 161-0140 | Polymerization (A4P0) |
| 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] Dihydrochloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 017-19362 | Polymerization (VA-044) |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M1753-100ML | Clearing solution (mPACT) |
| Tween-20 | Georgiachem | 9005-64-5 | nRIMS solution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | Immuno Staining |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bovogen | BSA100 | Immuno Staining |
| Heparin | Merck Millipore | 375095 | Perfusion (PBS) |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-25G | nRIMS solution |
| PECAM-CD31 antibody | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-28188 | Immuno Staining |
| Goat anti-rabbit-IgG Cy3 fluorescent conjugate | Jackson ImmunoResearch Inc. | 111-165-003 | Immuno Staining |
| 4% Paraformaldehyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | Perfusion, Polymerization |
| 20X Phosphate Buffered Saline (pH 7.4) | Tech & Innovation | BPB-9121 | Perfusion, Buffer |
| 10 mL stripette | Coatar | 4488 | Solution transfer |
| 50 mL tube | Falcon | 352070 | Clearing tube |
| 35 mm Cell culture dish | SPL | 20035 | Imaging |
| Confocal dish | SPL | 211350 | Imaging |
| 1 mL syringe | Korea vaccine Co., Ltd | 26G 1/2 | Anesthetize |
| 50 mL syringe | Korea vaccine Co., Ltd | 21G1 1/4 | Perfusion |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A3553 | Polymerization (A4P0) |
| Whatman 3MM paper | Sigma-Aldrich | Z270849 | Blotting paper for gel removal |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM780 | Imaging |
| ZEN lite Software | Zeiss | ZEN 2012 | Imaging |
| Peristaltic pump | Longerpump | BT100-1F | Perfusion |
| EasyGel | Lifecanvas Technologies | EasyGel | Tissue gel hybridization system |
Referenzen
- Zhu, X., Xia, Y., Wang, X., Si, K., Gong, W. Optical brain imaging: A powerful tool for neuroscience. Neurosci Bull. 33 (1), 95-102 (2017).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Sci Rep. 7, 44810 (2017).
- Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Dev Biol. 14, 48 (2014).
- Jensen, K. H. R., Berg, R. W. Advances and perspectives in tissue clearing using CLARITY. J Chem Neuroanat. 86, 19-34 (2017).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nat Protoc. 10 (11), 1860-1896 (2015).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Sci Rep. 6, 34331 (2016).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Exp Mol Med. 48 (12), 274 (2016).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY. J Vis Exp. (112), (2016).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: A simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Choi, B. R., et al. Increased expression of the receptor for advanced glycation end products in neurons and astrocytes in a triple transgenic mouse model of Alzheimer’s disease. Exp Mol Med. 46, 75 (2014).
- Chang, D. J., et al. Contralaterally transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor cells (ENStem-A) migrate and improve brain functions in stroke-damaged rats. Exp Mol Med. 45, 53 (2013).
- Kim, T. K., et al. Analysis of differential plaque depositions in the brains of Tg2576 and Tg-APPswe/PS1dE9 transgenic mouse models of Alzheimer disease. Exp Mol Med. 44 (8), 492-502 (2012).
- Kinameri, E., et al. Prdm proto-oncogene transcription factor family expression and interaction with the Notch-Hes pathway in mouse neurogenesis. PLoS One. 3 (12), e3859 (2008).
