Summary

Nuevo pasivo claro los métodos para la producción rápida de transparencia óptica en todo el tejido del SNC

Published: May 08, 2018
doi:

Summary

Aquí, presentamos dos metodologías novedosas, psPACT y mPACT, para lograr la máxima transparencia óptica y posterior análisis microscópico de vascularización del tejido en el roedor intacto todo CNS.

Abstract

Desde el desarrollo de la claridad, un bioelectroquímicos limpieza técnica permite mapeo tridimensional fenotipo dentro de tejidos transparentes, una multitud de metodologías de novela claro incluyendo cúbicos (proyección de imagen de cerebro claro y sin obstrucciones cócteles y análisis computacional), interruptor (todo el sistema de control de tiempo de interacción) y la cinética de los productos químicos, mapa (ampliada análisis del proteoma), Pacto (técnica de claridad pasivo), se han establecido para ampliar las herramientas existentes para el análisis microscópico de tejidos biológicos. El presente estudio pretende mejorar y optimizar el procedimiento de Pacto original para una gran variedad de tejidos de roedores intactos, incluyendo el todo sistema nervioso central (CNS), riñones, bazo y embriones de ratón todo. Denominado psPACT (Pacto de proceso separado) y mPACT (Pacto modificado), estas nuevas técnicas proporcionan medios altamente eficaces de asignación de circuitos de células y visualizar estructuras subcelulares en los tejidos normales y patológicos intactos. En el siguiente protocolo, proporciona un contorno detallado, paso a paso cómo lograr separación máxima del tejido con mínima invasión de su integridad estructural a través de psPACT y mPACT.

Introduction

Un objetivo fundamental de la investigación científica y clínica consiste en lograr una comprensión completa de la estructura de órgano y función; sin embargo, la naturaleza extremadamente compleja de órganos mamíferos a menudo sirve como una barrera para alcanzar plenamente este objetivo1. CLARIDAD (intercambian lípidos claro cruzado por hibridación acrilamida rígido compatible con la proyección de imagen Tisssue-hidrogel)2,3,4, que implica la construcción de un híbrido basados en acrilamida hidrogel de tejidos intactos, logra separación óptica de una variedad de órganos, incluyendo el cerebro, el hígado y el bazo, mientras que preserva su integridad estructural5. CLARIDAD así ha permitido no sólo la visualización, sino también la oportunidad de disecar finamente complejas redes celulares y morfologías de tejido sin necesidad de seccionar.

Para lograr la separación de tejido, claridad emplea métodos electroforéticos para eliminar el contenido de lípidos de la muestra de mano. Mientras que la claridad se ha observado para producir híbridos de tejido-hidrogel físicamente estable, los estudios han demostrado que el uso de métodos de electroforesis tejido claro (ETC) produce resultados variables en cuanto a la calidad del tejido, incluyendo dorado, daño del epítopo, y pérdida de proteína de5,6. Para tratar estos temas, protocolos modificados como Pacto (pasivo claridad técnica), que sustituye el tratamiento etc. con una técnica pasiva, detergente iónico delipidation basado, han sido desarrollados7,8,9. A pesar de lograr una mayor consistencia en los resultados, sin embargo, pacto requiere más tiempo para obtener la máxima separación. Además, ninguna de estas técnicas todavía se aplicaron a la forma entera de la CNS, o en modelos más grandes roedores como las ratas y conejillos de Indias.

El presente estudio pretende abordar estas limitaciones proponiendo metodologías novela, psPACT (Pacto de proceso separado) y mPACT (Pacto modificado), para facilitar la rápida liquidación de CNS todo los órganos internos en modelos de ratón y rata10. Específicamente, psPACT procesos de tejidos en acrilamida 4% y 0.25% VA-044 en dos pasos separados durante la formación del hidrogel; mPACT esencialmente implica los mismos pasos, pero complementa la solución claro basado en SDS 0,5% α-thioglycerol como un reactivo clave. Ambas técnicas aprovechan la endógena sistémica y cerebroespinal circulatorio para reducir significativamente el tiempo necesario para producir la separación óptica. Como una prueba de principio, nos demuestran el uso de la microscopia confocal para analizar patrones de vasos sanguíneos en los tejidos despejado10.

Protocol

Todos los procedimientos han sido aprobados por el Comité de ética de la investigación adecuada en el Colegio de medicina de la Universidad de Yonsei. Todos los animales experimentales son sacrificados con arreglo a las directrices del Comité de cuidado de los animales de laboratorio en la Universidad de medicina de la Universidad de Yonsei. 1. preparación de reactivos PRECAUCIÓN: Paraformaldehido (PFA), acrilamida y sodio dodecil sulfato (SDS) son tóxicos irri…

Representative Results

Generación de un modelo transparente del CNS todo claro pasivo optimizado técnicas Espacio óptico de los tejidos CNS todo ratón y rata se logró rápidamente utilizando diversas técnicas de compensación pasiva (figura 1). Un esquema de tejido claro con el tiempo se muestra en la figura 2A. A diferencia del método original del Pacto, psPACT (Pacto…

Discussion

Mientras que los métodos de extracción pasiva, no electroforéticas emplean en pacto mejoró significativamente la consistencia alcanzada con tejido anterior claro métodos tales como la claridad2,3,4,7 , 8, la técnica aún tiene varios defectos, el más acuciante de que es la longitud de tiempo requerido para lograr el máximo tejido claridad<sup class="xr…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por el proyecto cerebro Corea 21 PLUS para ciencias médicas, Universidad de Yonsei. Además, este trabajo fue apoyado por una beca de la Fundación Nacional de investigación de Corea (NRF-2017R1D1A1B03030315).

Materials

Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Affymetrix, Inc. 75819 Clearing solution
Nycodenz Axia-Shield 1002424 nRIMS solution
40% Acrylamide Solution Bio Rad Laboratories, Inc. 161-0140 Polymerization (A4P0)
2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] Dihydrochloride Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 017-19362 Polymerization (VA-044)
1-Thioglycerol Sigma-Aldrich M1753-100ML Clearing solution (mPACT)
Tween-20 Georgiachem 9005-64-5 nRIMS solution
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787-50ML Immuno Staining
Bovine serum albumin (BSA) Bovogen BSA100 Immuno Staining
Heparin Merck Millipore 375095 Perfusion (PBS)
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002-25G nRIMS solution
PECAM-CD31 antibody Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-28188 Immuno Staining
Goat anti-rabbit-IgG Cy3 fluorescent conjugate Jackson ImmunoResearch Inc. 111-165-003 Immuno Staining
4% Paraformaldehyde Tech & Innovation BPP-9004 Perfusion, Polymerization
20X Phosphate Buffered Saline (pH 7.4) Tech & Innovation BPB-9121 Perfusion, Buffer
10 mL stripette Coatar 4488 Solution transfer
50 mL tube Falcon 352070 Clearing tube
35 mm Cell culture dish SPL 20035 Imaging
Confocal dish SPL 211350 Imaging
1 mL syringe Korea vaccine Co., Ltd 26G 1/2 Anesthetize 
50 mL syringe Korea vaccine Co., Ltd 21G1 1/4 Perfusion
Acrylamide Sigma-Aldrich A3553 Polymerization (A4P0)
Whatman 3MM paper Sigma-Aldrich Z270849 Blotting paper for gel removal
Confocal microscope Zeiss LSM780 Imaging
ZEN lite Software Zeiss ZEN 2012 Imaging
Peristaltic pump Longerpump BT100-1F Perfusion
EasyGel Lifecanvas Technologies EasyGel Tissue gel hybridization system

Referenzen

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Diesen Artikel zitieren
Woo, J., Lee, E. Y., Park, H., Park, J. Y., Cho, Y. E. Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue. J. Vis. Exp. (135), e57123, doi:10.3791/57123 (2018).

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