पूरे सीएनएस ऊतक में ऑप्टिकल पारदर्शिता के तेजी से उत्पादन के लिए उपंयास निष्क्रिय समाशोधन तरीकों
Summary
यहाँ, हम अधिक से अधिक ऑप्टिकल पारदर्शिता और बरकरार मूषक पूरे सीएनएस में ऊतक vasculature के बाद के सूक्ष्म विश्लेषण को प्राप्त करने के लिए दो उपंयास के तरीके, psPACT और mPACT, पेश करते हैं ।
Abstract
स्पष्टता के विकास के बाद से, एक bioelectrochemical समाशोधन तकनीक है कि तीन के लिए अनुमति देता है आयामी phenotype मानचित्रण पारदर्शी ऊतकों के भीतर, उपंयास समाशोधन के तरीके की एक भीड़ घन सहित (स्पष्ट, अबाधित ब्रेन इमेजिंग कॉकटेल और गणनात्मक विश्लेषण), स्विच (प्रणाली संपर्क समय और रसायनों के कैनेटीक्स के व्यापक नियंत्रण), नक्शा (proteome के बढ़ाया विश्लेषण), और समझौता (निष्क्रिय स्पष्टता तकनीक), आगे के लिए मौजूदा toolkit का विस्तार करने के लिए स्थापित किया गया है जैविक ऊतकों का सूक्ष्म विश्लेषण । वर्तमान अध्ययन पर सुधार और पूरे केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस), गुर्दे, तिल्ली, और पूरे माउस भ्रूण सहित बरकरार मूषक ऊतकों की एक सरणी के लिए मूल समझौता प्रक्रिया का अनुकूलन करना है । psPACT (प्रक्रिया-अलग संधि) और mPACT (संशोधित समझौता), इन उपंयास तकनीक मानचित्रण सेल सर्किट और बरकरार सामांय और रोग के ऊतकों में उपसेलुलर संरचनाओं visualizing के अत्यधिक प्रभावोत्पादक साधन प्रदान करते हैं । निंनलिखित प्रोटोकॉल में, हम psPACT और mPACT के माध्यम से अपने संरचनात्मक अखंडता के ंयूनतम आक्रमण के साथ अधिक से अधिक ऊतक निकासी प्राप्त करने के लिए कैसे पर एक विस्तृत, कदम दर कदम रूपरेखा प्रदान करते हैं ।
Introduction
वैज्ञानिक और नैदानिक जांच का एक बुनियादी उद्देश्य अंग संरचना और समारोह की एक पूरी समझ प्राप्त करना शामिल है; हालांकि, स्तनधारी अंगों की बेहद जटिल प्रकृति अक्सर पूरी तरह से इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए एक बाधा के रूप में कार्य करता है1. स्पष्टता (स्पष्ट लिपिड विमर्श Acrylamide-संकर कठोर इमेजिंग-संगत Tisssue-hYdrogel)2,3,4, जो बरकरार ऊतकों से एक Acrylamide आधारित hYdrogel संकर का निर्माण शामिल है, प्राप्त अपने संरचनात्मक अखंडता के संरक्षण, जबकि मस्तिष्क, जिगर, और तिल्ली सहित अंगों की एक किस्म के ऑप्टिकल क्लीयरेंस,5. स्पष्टता इस प्रकार न केवल दृश्य सक्षम किया गया है, लेकिन यह भी काटना को पतले जटिल सेलुलर नेटवर्क और ऊतक morphologies के लिए खंड की आवश्यकता के बिना अवसर ।
आदेश में ऊतक निकासी प्राप्त करने के लिए, स्पष्टता electrophoretic तरीकों को रोजगार के लिए हाथ में नमूना के लिपिड सामग्री को दूर । जबकि स्पष्टता शारीरिक रूप से स्थिर ऊतक के उत्पादन के लिए उल्लेख किया गया है-hydrogel संकर, अध्ययनों से पता चला है कि इसके उपयोग electrophoretic ऊतक समाशोधन (आदि) तरीके ऊतक गुणवत्ता के मामले में चर परिणामों की पैदावार, तमंचा सहित, epitope क्षति, और प्रोटीन हानि5,6. इन मुद्दों को संबोधित करने के लिए, इस तरह के समझौते के रूप में संशोधित प्रोटोकॉल (निष्क्रिय स्पष्टता तकनीक), जो एक निष्क्रिय, ईओण-डिटर्जेंट आधारित लिपिड तकनीक के साथ आदि उपचार की जगह,7विकसित किया गया है,8,9। परिणामों में एक अधिक से अधिक निरंतरता प्राप्त करने के बावजूद, तथापि, इमानदारी अधिक से अधिक मंजूरी प्राप्त करने के लिए समय की आवश्यकता है । इसके अलावा, इन तकनीकों में से कोई भी अभी तक पूरे सीएनएस फार्म, या चूहों और गिनी सूअरों के रूप में बड़ा कुतर मॉडल में लागू किया गया है ।
वर्तमान अध्ययन के लिए उपंयास के तरीके का प्रस्ताव द्वारा इन सीमाओं का पता चाहता है, psPACT (प्रक्रिया अलग समझौता) और mPACT (संशोधित समझौता), पूरे सीएनएस और दोनों माउस और चूहे मॉडल में आंतरिक अंगों की तेजी से मंजूरी की सुविधा के लिए10। विशेष रूप से, psPACT ऊतकों में 4% acrylamide और ०.२५% VA-०४४ hydrogel गठन के दौरान दो अलग चरणों में प्रक्रियाओं; mPACT अनिवार्य रूप से एक ही कदम शामिल है, लेकिन पूरक एसडीएस-आधारित समाशोधन समाधान ०.५% α-thioglycerol के साथ एक प्रमुख एजेंट के रूप में । दोनों तकनीक अंतर्जात प्रणालीगत और मस्तिष्कमेरु संचार प्रणालियों का दोहन करने के लिए काफी ऑप्टिकल मंजूरी का उत्पादन करने की जरूरत समय कम । सिद्धांत का एक सबूत के रूप में, हम फोकल माइक्रोस्कोप के उपयोग को मंजूरी दे दी ऊतकों में रक्त वाहिका पैटर्न का विश्लेषण प्रदर्शित करता है10।
Protocol
Representative Results
Discussion
जबकि निष्क्रिय, गैर electrophoretic निष्कर्षण समझौते में कार्यरत तरीके काफी स्पष्टता2,3,4,7 के रूप में पिछले ऊतक समाशोधन तरीकों के साथ प्राप्त संगति में सुधार , <…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को ब्रेन कोरिया 21 प्लस प्रोजेक्ट फॉर मेडिकल साइंस, Yonsei यूनिवर्सिटी ने सपोर्ट किया था । इसके अलावा, यह काम कोरिया की नेशनल रिसर्च फाउंडेशन (एनआरएफ-2017R1D1A1B03030315) से अनुदान द्वारा समर्थित था ।
Materials
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Affymetrix, Inc. | 75819 | Clearing solution |
| Nycodenz | Axia-Shield | 1002424 | nRIMS solution |
| 40% Acrylamide Solution | Bio Rad Laboratories, Inc. | 161-0140 | Polymerization (A4P0) |
| 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] Dihydrochloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 017-19362 | Polymerization (VA-044) |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M1753-100ML | Clearing solution (mPACT) |
| Tween-20 | Georgiachem | 9005-64-5 | nRIMS solution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | Immuno Staining |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bovogen | BSA100 | Immuno Staining |
| Heparin | Merck Millipore | 375095 | Perfusion (PBS) |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-25G | nRIMS solution |
| PECAM-CD31 antibody | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-28188 | Immuno Staining |
| Goat anti-rabbit-IgG Cy3 fluorescent conjugate | Jackson ImmunoResearch Inc. | 111-165-003 | Immuno Staining |
| 4% Paraformaldehyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | Perfusion, Polymerization |
| 20X Phosphate Buffered Saline (pH 7.4) | Tech & Innovation | BPB-9121 | Perfusion, Buffer |
| 10 mL stripette | Coatar | 4488 | Solution transfer |
| 50 mL tube | Falcon | 352070 | Clearing tube |
| 35 mm Cell culture dish | SPL | 20035 | Imaging |
| Confocal dish | SPL | 211350 | Imaging |
| 1 mL syringe | Korea vaccine Co., Ltd | 26G 1/2 | Anesthetize |
| 50 mL syringe | Korea vaccine Co., Ltd | 21G1 1/4 | Perfusion |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A3553 | Polymerization (A4P0) |
| Whatman 3MM paper | Sigma-Aldrich | Z270849 | Blotting paper for gel removal |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM780 | Imaging |
| ZEN lite Software | Zeiss | ZEN 2012 | Imaging |
| Peristaltic pump | Longerpump | BT100-1F | Perfusion |
| EasyGel | Lifecanvas Technologies | EasyGel | Tissue gel hybridization system |
Referenzen
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