Nieuwe passieve methoden voor de snelle productie van optische transparantie in hele CNS weefsel wissen
Summary
Hier presenteren we twee nieuwe methodologieën, psPACT en mPACT, voor het bereiken van maximale optische transparantie en latere microscopische analyse van weefsel therapieën in het intact knaagdier hele CNS.
Abstract
Sinds de ontwikkeling van duidelijkheid, een bioelectrochemical clearing techniek die het mogelijk maakt voor toewijzing van de driedimensionale fenotype binnen transparante weefsels, een veelheid van nieuwe clearing methodologieën, met inbegrip van CUBIC (de weergave van de duidelijke, unobstructed hersenen cocktails en computationele analyse), schakelaar (systeembrede controle van interactie tijd) en kinetiek van chemische stoffen, kaart (vergrote analyse van het proteoom), PACT (passieve duidelijkheid techniek), zijn opgezet en verder uit te breiden de bestaande toolkit voor de microscopische analyse van biologische weefsels. De huidige studie is gericht op het verbeteren en optimaliseren van de oorspronkelijke PACT procedure voor een matrix van intact knaagdier weefsel, met inbegrip van de hele centrale zenuwstelsel (CNS), de nieren, de milt, en de hele muis embryo’s. PsPACT (proces-aparte PACT) en mPACT (gemodificeerde PACT) genoemd, dienen deze nieuwe technieken als zeer doeltreffend middel om mapping cel circuits en visualiseren van subcellular structuren in intact normale en pathologische weefsels. In het volgende protocol bieden wij een gedetailleerde, stapsgewijze overzicht over het bereiken van maximale weefsel goedkeuring met minimale invasie van hun structurele integriteit via psPACT en mPACT.
Introduction
Een fundamentele doelstelling van wetenschappelijke en klinische onderzoek omvat het bereiken van een volledig inzicht in de structuur van het orgel en functie; echter dient de buitengewoon complexe aard van zoogdieren organen vaak als een barrière voor het volledig bereiken van deze doelstelling1. DUIDELIJKHEID (duidelijk lipide-uitgewisseld Acrylamide-gekruist rigide Imaging-compatibele Tisssue-hYdrogel)2,3,4, waarbij de opbouw van een hybride acrylamide gebaseerde hydrogel uit intact weefsels, behaalt optische Goedkeuringvande allerlei organen, met inbegrip van de hersenen, lever en milt, met behoud van hun structurele integriteit5. DUIDELIJKHEID heeft dus niet alleen de visualisatie, maar ook de mogelijkheid om complexe cellulaire netwerken en weefsel morphologies zonder de noodzaak voor afdelen fijn te ontleden.
Met het oog op goedkeuring van het weefsel, hanteert duidelijkheid elektroforetische methodes te verwijderen van het vetgehalte van het monster bij de hand. Terwijl duidelijkheid is opgemerkt voor de productie van fysiek stabiele weefsel-hydrogel hybriden, studies hebben aangetoond dat het gebruik van elektroforetische weefsel clearing (ETC) methoden variabele resultaten in termen van kwaliteit van weefsel levert, met inbegrip van bruinen, epitoop schade, en eiwit verlies5,6. Om deze kwesties te behandelen, geweest gewijzigde protocollen zoals PACT (passieve duidelijkheid techniek), waarbij de enz behandeling wordt vervangen door een passieve, Ionische-wasmiddel op basis delipidation-techniek, ontwikkelde7,8,9. Ondanks het bereiken van een grotere samenhang van resultaten, vereist PACT echter meer tijd om te verkrijgen maximale klaring. Bovendien, geen van deze technieken hebben nog zijn toegepast bij het hele CNS-formulier of in grotere modellen, knaagdieren zoals ratten en cavia’s.
De huidige studie tracht te stellen deze beperkingen door het voorstellen van nieuwe methodologieën, psPACT (proces-aparte PACT) en mPACT (gemodificeerde PACT), ter vergemakkelijking van de snelle goedkeuring van het hele CNS en inwendige organen in zowel muis en rat modellen10. Specifiek, psPACT verwerkt weefsels in 4% acrylamide en 0,25% VA-044 uitgebracht in twee afzonderlijke stappen tijdens hydrogel vorming; mPACT hoofdzakelijk omvat de dezelfde stappen, maar vormt een aanvulling op de clearing SDS gebaseerde oplossing met 0,5% α-thioglycerol als een belangrijk reagens. Beide technieken benutten de endogene systemische en hersen bloedsomloop systems om aanzienlijk minder tijd nodig voor de productie van optische klaring. Als een bewijs van beginsel tonen wij het gebruik van de confocal microscopie bloedvat patronen in de gewiste weefsels10analyseren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Terwijl de passieve, niet-elektroforetische extractiemethoden werkzaam verbeterd PACT aanzienlijk de consistentie bereikt met vorige weefsel clearing methoden zoals duidelijkheid2,,3,,4,7 , 8, de techniek draagt nog steeds een aantal tekortkomingen, de meest urgente van die de lengte van de benodigde tijd is voor het bereiken van maximale weefsel duidelijkheid…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de hersenen Korea 21 PLUS Project voor de medische wetenschap, Yonsei Universiteit. Dit werk werd bovendien gesteund door een subsidie van de National Research Foundation Korea (NRF-2017R1D1A1B03030315).
Materials
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Affymetrix, Inc. | 75819 | Clearing solution |
| Nycodenz | Axia-Shield | 1002424 | nRIMS solution |
| 40% Acrylamide Solution | Bio Rad Laboratories, Inc. | 161-0140 | Polymerization (A4P0) |
| 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] Dihydrochloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 017-19362 | Polymerization (VA-044) |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M1753-100ML | Clearing solution (mPACT) |
| Tween-20 | Georgiachem | 9005-64-5 | nRIMS solution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | Immuno Staining |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bovogen | BSA100 | Immuno Staining |
| Heparin | Merck Millipore | 375095 | Perfusion (PBS) |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-25G | nRIMS solution |
| PECAM-CD31 antibody | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-28188 | Immuno Staining |
| Goat anti-rabbit-IgG Cy3 fluorescent conjugate | Jackson ImmunoResearch Inc. | 111-165-003 | Immuno Staining |
| 4% Paraformaldehyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | Perfusion, Polymerization |
| 20X Phosphate Buffered Saline (pH 7.4) | Tech & Innovation | BPB-9121 | Perfusion, Buffer |
| 10 mL stripette | Coatar | 4488 | Solution transfer |
| 50 mL tube | Falcon | 352070 | Clearing tube |
| 35 mm Cell culture dish | SPL | 20035 | Imaging |
| Confocal dish | SPL | 211350 | Imaging |
| 1 mL syringe | Korea vaccine Co., Ltd | 26G 1/2 | Anesthetize |
| 50 mL syringe | Korea vaccine Co., Ltd | 21G1 1/4 | Perfusion |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A3553 | Polymerization (A4P0) |
| Whatman 3MM paper | Sigma-Aldrich | Z270849 | Blotting paper for gel removal |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM780 | Imaging |
| ZEN lite Software | Zeiss | ZEN 2012 | Imaging |
| Peristaltic pump | Longerpump | BT100-1F | Perfusion |
| EasyGel | Lifecanvas Technologies | EasyGel | Tissue gel hybridization system |
Referenzen
- Zhu, X., Xia, Y., Wang, X., Si, K., Gong, W. Optical brain imaging: A powerful tool for neuroscience. Neurosci Bull. 33 (1), 95-102 (2017).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Sci Rep. 7, 44810 (2017).
- Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Dev Biol. 14, 48 (2014).
- Jensen, K. H. R., Berg, R. W. Advances and perspectives in tissue clearing using CLARITY. J Chem Neuroanat. 86, 19-34 (2017).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nat Protoc. 10 (11), 1860-1896 (2015).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Sci Rep. 6, 34331 (2016).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Exp Mol Med. 48 (12), 274 (2016).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY. J Vis Exp. (112), (2016).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: A simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Choi, B. R., et al. Increased expression of the receptor for advanced glycation end products in neurons and astrocytes in a triple transgenic mouse model of Alzheimer’s disease. Exp Mol Med. 46, 75 (2014).
- Chang, D. J., et al. Contralaterally transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor cells (ENStem-A) migrate and improve brain functions in stroke-damaged rats. Exp Mol Med. 45, 53 (2013).
- Kim, T. K., et al. Analysis of differential plaque depositions in the brains of Tg2576 and Tg-APPswe/PS1dE9 transgenic mouse models of Alzheimer disease. Exp Mol Med. 44 (8), 492-502 (2012).
- Kinameri, E., et al. Prdm proto-oncogene transcription factor family expression and interaction with the Notch-Hes pathway in mouse neurogenesis. PLoS One. 3 (12), e3859 (2008).
