Klonen analyse van embryonale hematopoietische stamcellen precursoren met eencellige Index sorteren gecombineerd met Endothelial Niche co celkweek

Klonen studies is gebleken heterogeniteit in de lange termijn engraftment eigenschappen van volwassen HSCs, nieuwe inzicht bijbrengen in HSC subtypen en wijzigingen in de HSC gedrag tijdens veroudering¹. Echter, soortgelijke studies van embryonale HSCs en hun uitgangsstoffen zijn uitdagender. Tijdens de vroege embryonale ontwikkeling, HSCs die ontstaan is uit een populatie van precursoren bekend als hemogenic endotheel in een voorbijgaande proces bedoeld als het endotheel hematopoietische overgang². Het eerste HSC, gedefinieerd door hun vermogen om te leveren robuuste, op lange termijn multilineage engraftment na transplantatie in geconditioneerde volwassen geadresseerden, worden niet gedetecteerd totdat na embryonale dag 10.5 (E10.5) in het lymfkliertest embryo, met zeer lage frequentie³ . Tijdens hun ontwikkeling, moeten voorlopers van HSC (pre-HSC) die voortvloeien uit hemogenic endotheel rijping voorafgaand aan het verwerven van de eigenschappen van volwassen HSC die voorzien in efficiënte engraftment in^4,5 van de tests van de transplantatie ondergaan ^{, 6}. de studie van zeldzame HSC oorsprong, een veelheid van hematopoietische progenitorcellen met erythroid, verduisterend myeloïde en lymfoïde potentieel al worden gedetecteerd vóór de opkomst van HSC van pre-HSC^7,8. Pre-HSC onderscheiden van andere hematopoietische progenitorcellen vereist dus, methoden voor klonaal cellen isoleren en hen voorzien van voldoende voor hun rijping signalen naar HSC, om te ontdekken hun engraftment eigenschappen in het testen van de transplantatie.

Een aantal benaderingen zijn beschreven die voldoende zijn voor de detectie van pre-Help en ondersteuning door ex vivo of in vivo rijping naar HSC. Ex vivo methoden hebben afhankelijk van de cultuur van embryonale weefsels, zoals de AGM-regio, waar het eerste HSC in ontwikkeling⁹worden gedetecteerd. Voortbouwend op deze methoden, protocollen waarin de dissociatie opgenomen, hebben sorteren, en opnieuw aggregatie van AVA weefsels toegestaan de karakterisatie van gesorteerde populaties met HSC precursoren tijdens de ontwikkeling van E9.5 naar E11.5 in de para-aorta splanchnopleura (P-Sp) / AGM regio’s^4,5,10; deze benaderingen zijn echter niet vatbaar voor high-throughput analyse van precursoren op het niveau van de eencellige vereist voor klonen analyse. Ook in vivo rijping door transplantatie in pasgeboren muizen, waar de communicatie wordt geacht te zijn meer geschikt voor de ondersteuning van eerdere fasen van HSC precursoren, ook heeft onderzoek van gesorteerde populaties van de dooierzak en AVA / P-Sp (P-Sp is de regio van de voorloper van de AVA) met kenmerken van pre-HSC, maar deze methoden ook niet te voorzien van een robuust platform voor single cell analysis^11,12.

Studies van Rafii et al. aangetoond dat Akt-geactiveerde endothelial cel (EG) stroma kan bieden een niche-substraat voor de ondersteuning van volwassen HSC zelf-vernieuwing in vitro^13,14,15. We onlangs vastgesteld dat Akt-geactiveerde EG afgeleid van de AVA regio (AGM-EG) een niche geschikt in vitro voor de rijping van hemogenic precursoren biedt, zo vroeg als E9 in ontwikkeling, tot volwassene-enten HSC, evenals de latere geïsoleerd zelf-vernieuwing van de gegenereerde HSC¹⁶. Gezien het feit dat dit systeem maakt gebruik van een eenvoudige CO 2-dimensionale cultuur, is het gemakkelijk aanpasbaar voor klonen analyse van het potentieel van de HSC van individueel geïsoleerde hemogenic precursoren.

We hebben onlangs gemeld dat een benadering van het potentieel van de HSC van klonen hemogenic precursoren assay door het combineren van index sortering van individuele hemogenic precursoren van lymfkliertest embryo’s met AGM-EG mede cultuur en latere functionele analyse van transplantatie testen van¹⁷. Het sorteren van de index is een modus van fluorescentie-activated cell sorting (FACS) dat records (indexen) alle fenotypische parameters (d.w.z., voorwaartse scatter (FSC-A), naast scatter (WS-A), fluorescentie parameters) van elk afzonderlijk gesorteerde cel dat deze functies kunnen met terugwerkende kracht worden gecorreleerd aan latere functionaalanalyse na sorteren. FACS software registreert beide fenotypische informatie voor elke cel en de positie per putje van de 96-wells-plaat waarin het werd geplaatst. Deze techniek is eerder elegant gebruikt voor het identificeren van heterogeniteit in volwassen HSC, fenotypische parameters die verder verrijken voor de lange termijn enten subset van HSC, en fenotypische parameters van HSC correleren met transcriptionele bepalen eigenschappen op de single cell niveau^18,19. Hier, bieden wij gedetailleerde methodologie van deze aanpak waarmee identificatie van unieke fenotypische parameters en bloedlijn bijdragen van pre-Help en ondersteuning tijdens de vroege stadia van embryonale ontwikkeling.