Análise clonal de precursores embrionárias células-tronco hematopoiéticas usando índice de célula única classificação combinada com células endoteliais nicho co-cultura

Clonais estudos revelaram heterogeneidade nas propriedades de enxertia de longo prazo de linfócitos adultos, fornecendo a introspecção nova de subtipos HSC e mudanças no comportamento HSC durante envelhecimento¹. Entretanto, estudos semelhantes de linfócitos embrionários e seus precursores foram mais desafiadora. Durante o desenvolvimento embrionário precoce, linfócitos surgem de uma população de precursores, conhecida como endotélio hemogenic em um processo transitório referido como o endotelial de transição hematopoiéticas². O primeiro HSC, definido por sua capacidade de fornecer enxertia multilineage robusta, a longo prazo, seguindo o transplante no condicionado destinatários adultos, não são detectados até depois de dia embrionário 10.5 (E10.5) o embrião murino, com muito pouca frequência³ . Durante seu desenvolvimento, precursores da HSC (pre-HSC) decorrentes de endotélio hemogenic devem ser submetidas a maturação antes de adquirir as propriedades de HSC adulto que permitem uma eficiente enxertia em transplante ensaios^{4,5 , 6}. obscurecendo o estudo da origem HSC rara, uma infinidade de progenitores hematopoiéticos com eritroide, mieloide e linfoide potencial já são detectados antes do surgimento de HSC de pre-HSC^7,8. Assim, distinguir pre-HSC de outros progenitores hematopoiéticos exige métodos para isolar uma relação clonal células e fornecê-los com os sinais suficientes para sua maturação de HSC, para detectar suas propriedades de enxertia em ensaios de transplante.

Uma série de abordagens têm sido descrita que permitem a detecção de pre-HSC pela maturação ex vivo ou no vivo de HSC. Ex vivo métodos têm dependia da cultura de tecidos embrionários, como a região AGM, onde o primeiro HSC são detectadas no desenvolvimento⁹. Construindo sobre esses métodos, protocolos que incorporam a dissociação, a classificação e re-agregação dos tecidos AGM permitiram a caracterização das populações classificadas contendo precursores HSC durante o desenvolvimento de E9.5 para E11.5 no Pará-aórtica splanchnopleura (P-Sp) / AGM regiões^4,5,10; no entanto, essas abordagens não são passíveis de análise do elevado-throughput de precursores no nível da célula única necessária para análise clonal. Da mesma forma, na vivo maturação por transplante em ratos recém-nascidos, onde o microambiente presume-se ser mais adequado para o apoio das fases anteriores de precursores HSC, permitiu também estudos de populações classificadas do saco vitelino e AGM / P-Sp (P-Sp é a região de precursor para o AGM) com características de pre-HSC, mas estes métodos também não proporcionar uma plataforma robusta para single cell análise^11,12.

Estudos de Rafii et al demonstraram que estroma de células endoteliais Akt-ativado (CE) pode fornecer um substrato de nicho para o apoio do adulto HSC auto-renovação em vitro^13,14,15. Recentemente determinamos que CE Akt-ativado derivado da região AGM (AGM-CE) fornece um nicho adequado em vitro para a maturação dos precursores hemogenic, isolado, tão cedo quanto E9 em desenvolvimento, para adulto-engrafting HSC, bem como a posterior autorenovação da gerado HSC¹⁶. Dado que este sistema emprega uma simples cultura de co 2-dimensional, é facilmente adaptável para clonal análise do potencial HSC de precursores hemogenic individualmente isolados.

Temos recentemente relatado uma abordagem a ensaiar o potencial HSC de precursores hemogenic clonal, combinando a classificação de índice de precursores hemogenic individuais de murino embriões com co-cultura AGM-CE e posterior análise funcional em transplante ensaios de¹⁷. Classificação de índice é um modo de fluorescência-ativado celular classificação (FACS) que registra (índices) todos os parâmetros fenotípicos (isto é, dispersão direta (FSC-A), lado dispersão (SSC-A), fluorescência parâmetros) de cada célula individualmente classificado que estes características podem ser retrospectivamente correlacionadas para posterior análise funcional após a classificação. FACS software grava ambas as informações fenotípicas para cada célula e posição/poço da placa de 96 poços, na qual ele foi colocado. Esta técnica anteriormente foi elegantemente usada para identificar a heterogeneidade na HSC adulto, determinar parâmetros fenotípicos que mais enriquecem para o subconjunto engrafting a longo prazo do HSC e correlacionam parâmetros fenotípicos de HSC com transcricional Propriedades para o single de pilha nível^18,19. Aqui, nós fornecemos uma metodologia detalhada desta abordagem que permite a identificação de parâmetros fenotípicos únicos e contribuições de linhagem de pre-HSC durante as fases iniciais de desenvolvimento embrionário.