Raccolta e l'estrazione di campioni d'aria professionale per l'analisi del DNA fungoso
Summary
Determinare la diversità fungina all’interno di un ambiente è un metodo utilizzato in studi di salute sul lavoro per identificare i pericoli per la salute. Questo protocollo descrive estrazione del DNA dai campioni d’aria professionali per l’amplificazione e sequenziamento delle regioni ITS fungine. Questo approccio rileva molte specie fungine che possono essere trascurati dai metodi tradizionali di valutazione.
Abstract
Tradizionali metodi di identificazione fungine esposizioni negli ambienti di lavoro, quali la cultura e gli approcci basati su microscopia, presentano alcune limitazioni che hanno provocato l’esclusione di molte specie. Gli avanzamenti nel campo negli ultimi due decenni hanno condotto i ricercatori di salute professionale a cui rivolgermi approcci molecolari per identificare i pericoli fungini. Questi metodi hanno portato nella rilevazione di molte specie all’interno degli ambienti indoor e sul lavoro che non sono stati rilevati utilizzando metodi tradizionali. Dettagli di questo protocollo un approccio per determinare la diversità fungina all’interno aria campioni attraverso estrazione del DNA genomico, amplificazione, sequenziamento e identificazione tassonomica di fungine interno trascritto regioni distanziale (ITS). I risultati di sequenziamento nella rilevazione di molte specie fungine che sono non rilevato o difficile da identificare a livello di specie mediante coltura o microscopia. Mentre questi metodi non forniscono misure quantitative dell’onere fungine, offrono un nuovo approccio all’identificazione del pericolo e può essere utilizzati per determinare la complessiva ricchezza di specie e la diversità all’interno di un ambiente di lavoro.
Introduction
Fungine esposizioni in ambienti indoor e sul lavoro possono causare morbidità respiratoria, compresa la sensibilizzazione allergica e asma1. Identificazione dei pericoli fungini è importante per la valutazione del rischio e prevenire l’esposizione del lavoratore. Questi pericoli fungini possono essere un risultato di contaminazione interna, intrusione di aria esterna o disturbi ambientali che provocano il trasporto di materiali fungine in aree dove i lavoratori sono presenti2. Metodi per valutare l’esposizione fungina hanno incluso campionamento cultura vitale, come pure l’identificazione microscopica delle spore fungine. Questi approcci hanno diverse limitazioni e spesso si affacciano molte specie fungine che potrebbero contribuire al generale fungine onere3. Approcci basati sulla cultura è in grado di distinguere solo quegli organismi fungine vitali che possono essere coltivate su terreni di coltura. Identificazione di spore fungine a livello di specie tramite microscopia può essere confuso dalle spore simili morfologie di condivisione. Entrambi i metodi sono altamente dipendenti micologi per analizzare ed identificare le specie fungine, con molti restanti non identificato.
Per migliorare le metodologie esistenti utilizzate nell’identificazione di rischio professionale e valutazioni dell’esposizione, molti ricercatori si sono rivolti a tecnologie molecolari. Approcci basati sul sequenziamento per la valutazione della diversità microbica all’interno degli ambienti indoor e sul lavoro hanno rivelato un ampio spettro di specie fungine incontrato rispetto ai metodi quali microscopia e vitale cultura3,4 ,5. Il metodo presentato qui descrive il campionamento dell’aria di ambienti di lavoro e l’estrazione del DNA genomico per l’identificazione di potenziali pericoli fungini. Identificazione del pericolo avviene mediante sequenziamento il distanziatore trascritto interno ribosomal nucleare o ITS, regioni che sono altamente variabili tra funghi e sono stati comunemente utilizzate per differenziare le specie fungine6,7, 8,9. Molte specie si trovano in ambienti di lavoro, come alcune specie appartenenti al phylum Basidiomycota, non sono identificabili nella cultura vitale e sono difficili da differenziare microscopicamente. Questi funghi sono stati osservati in alta abbondanza relativa all’interno degli ambienti indoor e sul lavoro, valutata dal sequenziamento fungine ITS regioni3,4,10. IL sequenziamento ha fornito una maggiore conoscenza della varietà di funghi all’interno di ambienti interni ed occupazionali rilevata.
Il protocollo descritto qui dettagli i metodi utilizzati per raccogliere, estrarre e amplificare fungine ITS regioni da bioaerosols per l’analisi di sequenza. Questo approccio utilizza il National Institute for Occupational Safety and Health (NIOSH) campionatore di aerosol di ciclone bistadio raccogliere le particelle nell’aria. Questo sampler è stato sviluppato per raccogliere bioaerosols e separato respirabile (≤ 4 µm di diametro aerodinamico) e non respirabile (> 4 µm di diametro aerodinamico) particelle, che consente per l’identificazione di organismi fungosi all’interno di ambienti che sono i più probabilità di essere inalato da un lavoratore11. Altri campionatori di aria, tra cui i campionatori di ciclone, sono disponibili sul mercato che hanno la capacità di raccogliere le particelle all’interno della gamma respirabile (< 4 µm) usando filtri12,13. Al contrario, il campionatore di aerosol NIOSH bistadio ciclone separa specie fungine basato sul loro diametro aerodinamico nelle provette monouso, in polipropilene che possono essere elaborati immediatamente per applicazioni a valle14.
I processi di estrazione del DNA genomico e amplificando le regioni ITS fungine sono dettagliati nel presente protocollo. Le metodologie di estrazione presentate sono state sviluppate specificamente per l’estrazione del DNA genomico da funghi e batteri, come molti kit commerciali di destinazione in particolare lieviti15, batteri o cellule di mammifero. I primers utilizzati in questo studio sono selezionati basati sulla loro copertura complessiva del 1 ITS fungine e ITS 2 regioni4,5. Sequenziamento di queste regioni consente il confronto di molte sequenze ITS sopraelevate, compresi quelli quella sequenza della regione 1 ITS, ITS 2 regione o regioni ITS 2 sia il suo 1. La diversità fungosa di campioni di aria raccolti in un’impostazione interna utilizzando che questi metodi sono illustrati, rivelando un sostanza numero di sequenze inseriti nei phyla Ascomycota e Basidiomycota, nonché altre sequenze appartenendo a phyla fungoso meno dominante, come Zygomycota. La grande diversità delle sequenze fungine identificati utilizzando questo approccio sarebbe non essere catturata utilizzando metodologie di identificazione di rischio tradizionali come coltivazione o microscopia. Sequenziamento delle regioni ITS fungine fornisce un metodo avanzato per identificare i pericoli fungini e consentire una migliore comprensione delle esposizioni fungine indoor e sul lavoro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Determinare la diversità fungina all’interno di un ambiente di lavoro utilizzando approcci basati su sequenziamento è migliorata individuazione ed esposizione di pericolosità fungine. Utilizzando questo approccio ha permesso per la rilevazione di molte altre specie fungine che spesso non vengono rilevati utilizzando metodi basati su microscopia di valutazione o di cultura. Qui viene presentato un metodo per campionamento bioaerosols da ambienti professionali e coperto e l’estrazione del DNA genomico dai campioni d’ari…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da un accordo tra agenzie tra NIOSH e NIEHS (AES12007001-1-0-6).
Materials
| NIOSH BC251 bioaerosol cyclone sampler | NIOSH | BC251 | The NIOSH sampler is not yet commercially available. Please contact William Lindsley, PhD (wlindsley@cdc.gov) for information on obtaining the NIOSH sampler |
| Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-373 | 1.5 mL polypropylene microcentrifuge tubes for air sampling; screw top threading must match the threading of the NIOSH sampler |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | 15 mL polypropylene tubes for air sampling |
| Clean Room Vinyl Tape, Easy-Remove, 1/4" Width | McMaster-Carr | 76505A1 | sealing tape |
| Filter Cassette, Clear Styrene, 37 mm | SKC Inc. | 225-3LF | 3-piece sampling cassette (no filter). Contains: cassette base, extension cowl, cassette cap and inlet/outlet plugs |
| PTFE hydrophobic fluoropore membrane filters, 3.0 µm, 37 mm | EMD Millipore | FSLW03700 | Contains: 37 mm, 3.0 µm PTFE filters and support pads |
| Fisherbrand filter forceps | Fisher Scientific | 09-753-50 | filter forceps |
| Model 502 Precision PanaPress | PanaVise | 502 | pneumatic cassette press is constructed from this precision arbor press |
| Scotch Super 33+ vinyl electrical tape | McMaster-Carr | 76455A21 | 19 mm tape |
| Multi-purpose Calibration Jar, Large | SKC Inc. | 225-112 | calibration jar |
| Universal PCXR4 Sample Pump | SKC Inc. | 224-PCXR4 | sampling pump |
| Mass Flowmeter 4140 | TSI Inc. | 4140 | flow meter |
| Roche High Pure PCR Template Kit | Roche Diagnostics | 11796828001 | Kit used for genomic DNA extraction. Contains: Lysis buffer, Binding buffer, Proteinase K, Inhibitor removal buffer, Wash buffer, Elution buffer, Glass fiber filter tubes and 2 ml collection tubes |
| Fisherbrand 2 mL Reinforced Polypropylene Screw Cap Tubes with Caps | Fisher Scientific | 15340162 | 2 mL reinforced tubes for bead homogenization |
| Glass beads, acid washed, 212-300 µm | Sigma-Aldrich | G1277 | glass beads |
| Fisher Scientific Bead Mill 24 Homogenizer | Fisher Scientific | 15-340-163 | bead homogenizer |
| CelLytic B Cell Lysis Reagent, 10X | Sigma-Aldrich | C8740 | lysis reagent |
| Platinum Taq polymerase | Invitrogen | 10966-018 | Contains: Platinum Taq polymerase, 10X PCR buffer (no MgCl2), 50 mM MgCl2, KB Extender |
| dNTP Mix | Invitrogen | 18427-088 | 10 mM dNTP mix |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | Kit used to purify fungal amplicons. Contains: Buffer PB (binding buffer), Buffer PE (washing buffer), Buffer EB (elution buffer), pH Indicator dye (optional), and GelPilot loading dye |
| Owl EasyCast Mini Gel Electrophoresis System | Thermo Fisher | B1 or B2 | |
| TrackIt 1 KB Plus DNA Ladder | Thermo Fisher | 10488-085 | DNA ladder |
Referenzen
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