التحفيز الكهربائي Transcranial المزمن وتسجيل إينتراكورتيكال في الفئران

Transcranial التحفيز الكهربائي (الامتحانات) أسلوب منهجي قيماً للتأثير على نشاط الدماغ بطريقة مقيدة وقتيا. اعتماداً على حجم وموضع من أقطاب التحفيز، قسم التدريب والامتحانات يمكن أن تؤثر على كميات كبيرة من الدماغ وانترين السكان العصبية تصطبغ^1،،من²³. Transcranial التحفيز التيار المباشر هو وافق الفعل طبيا لعلاج اضطراب الاكتئاب الرئيسي^4،5، والعديد من الدراسات تركز على إظهار آثار transcranial التحفيز المعرفي في البشر^{6 , 7}-علاوة على ذلك، واعدة وأبلغ النتائج فيما يتعلق بإمكانيات قسم التدريب والامتحانات في السيطرة على نوبات الصرع^،من⁸⁹.

وعلى الرغم من الأبحاث المكثفة، لا تزال هناك العديد من الأسئلة المفتوحة بشأن إليه مفصلة للعمل، والآثار الجانبية المحتملة، ونتائج طويلة الأجل لتطبيق هذا الأسلوب^10،،من¹¹¹². ولذلك، من المهم وضع بروتوكول قوية، واستنساخه للتحقيق في آثار الامتحانات في نماذج حيوانية. نظراً لأن الكثير من الاضطرابات (مثلاًوالاكتئاب والصرع وانفصام الشخصية) يمكن التحقيق على نطاق واسع إلا في الحيوانات مستيقظا، وطبيعة هذه الظروف الطبية عادة ما تتطلب علاجاً طويل الأمد، ونحن تقديم بروتوكول المزمن غرس أقطاب transcranial في الفئران. الطريقة المعروضة هنا يمكن استخدامها في الدراسات السلوكية أو يمكن دمجها مع غرس أقطاب التسجيل (أي، أسلاك، تحقيقات السيليكون، أقطاب جوكستاسيلولار) أو مع windows الجمجمة المزمن للتجارب الكهربية والتصوير الدراسات، على التوالي. استناداً إلى تصميم تجريبي، يمكن أن يكون توقيت المحفزات العشوائية أو تشغيل الحدث منبهات سلوكية محددة، أو بصمات الكهربية للدماغ خاصة الدول (المضبوطات، الذبذبات ثيتا)^{8، 11 , 13}.

من المهم أن نذكر أنه على النقيض من النهج البشرية المستخدمة حاليا، الذي يستخدم تجسيدا لأقطاب توضع على الجلد، هنا نعرض أسلوب الذي يستخدم حق غرس تحت الجلد على سطح العظم الصدغي، منذ الفئران بالكاد تتسامح مع أي شيء يوضع على الجلد الذي يمكن الوصول إليه بسهولة باستخدام الكفوف.

وتمشيا مع مبادئ الاستبدال، والحد، والصقل، وبسبب الطبيعة المزمنة لغرس، يساعد هذا الأسلوب لتقليل عدد الحيوانات، حيث يمكن توظيف كل الحيوانات في ظروف تجريبية مختلفة لأشهر، مما يسمح استخدام عدد أقل من الحيوانات لاختبار فرضيات مختلفة.

في هذه الدراسة، ونحن توفير بروتوكول transcranial التحفيز الكهربائي التصنيع (الشكل 1A-ب) تفصيلاً، خطوة بخطوة وإثبات المزمنة غرس هذه الأقطاب على عظام الصدغي البالغ من العمر ستة أشهر ذكر لونغ-إيفانز الفئران.

جميع الأساليب الموصوفة هنا وفقا لتوجيهات "مجلس الجماعات الأوروبية" (ECC 86/609) وأقرتها "اللجنة الأخلاقية" "البحوث الحيوانية" في ألبرت سزنت-Györgyi الطبية والصيدلية مركز جامعة سيغيد (الرابع عشر/218/2016).

1-تصنيع أقطاب التحفيز

1. لجعل التحفيز واحد إزالة القطب، قطع ست قطع طويلة 10 سم من أسلاك ربط الهاتفي مصغرة، 2 سم من الكسوة في نهاية واحدة، و 1 سم في الطرف الآخر.
2. تطور اثنين من الكابلات معا وجندي منهم إلى جانب مقشرة أقصر.
3. يكتسب قطاع التغليف الشريط ثلاثة من أي الدوائر المتكاملة مع حالة سوت-353.
4. غرزة الأسلاك الملتوية من خلال ثلاثة ثقوب للحزمة. ينبغي أن يكون الجزء مقشرة أطول من الأسلاك في التجاويف للحزمة. وضع الكابلات بحيث في نهاية المادة العازلة تمشيا مع حافة الثقوب.
5. وضع الأسمنت الأسنان على الثقوب لإصلاح الأسلاك.
   تنبيه: يجب أن يكون الأسمنت الأسنان الكثيفة ما يكفي لتجنب تسرب في التجويف الحزمة.
6. بمجرد الأسمنت طدت (الحد الأدنى 10 دقيقة)، انعكاس الحزمة ووضع طبقة رقيقة من superglue في حفرة لتشكيل ختم محكم نحو الأسمنت المليئة بالثغرات. تجنب الالتصاق الأسلاك مقشرة.
7. تطور الكابلات معا على الجانب مقشرة أقصر وجندي منهم (الشكل 1A).
8. الاستيلاء على الجزء مقشرة أطول من الأسلاك بطرف الملقط غرامة ولفه حول لهم، والتفاف عليها في التجاويف (الشكل 1B). قطع كبل الزائدة، إذا لزم الأمر.

2-تصنيع أقطاب تسجيل

1. جعل تسجيل واحد شهد الكهربائي الثلاثي (الشكل 1-د)، قطع قطعة طويلة سم واحد من أنابيب الفولاذ المقاوم للصدأ تستخدم الدوارة فائقة السرعة. إزالة fin من طرفي الأنبوب بإبرة حادة، وضمان أن الأنبوب نفاذية تماما ونظيفة من الحطام.
   ملاحظة: لا تستخدم كماشة، حيث أنها سوف تشوه الأنبوب.
2. ثني pin مباعدة مجلس مطلية بالذهب يبلغ طولها 3 سم شكل حامل ي-شكل الحد أدنى. قطع ساقه أطول من الشكل 'ي'، ولحام معا نعود بالشكل الأصلي لجعل مشتركة قابلة للفصل بين الجزء طويل الخطي، الذي سيعقد بالجهاز ستيريوتاكسيك، والشكل 'ش'، والتي سوف تعقد مسرى، والعمل كنقطة اتصال بترسيخ . الصق الأنبوب والساق أقصر من صاحب 'ي' معا. الصق بعض أشرطة طويلة 1 سم إضافية، إذا لزم الأمر، لتحقيق الاستقرار.
3. قطع 3 قطع من الأسلاك الكهربائي طويلة 2.5 سم مع الفولاذ المقاوم للصدأ، أظهرت المقص. تأكد من أن قطع واضحة وحادة، والعزل غير سليمة على السطح الدائري للسلك الكهربائي. تأكد أيضا من أن تلميح قطع عازمة ليس بسبب القوة المطبقة. منحنى 1 أو 2 ملم في نهاية واحدة من كل من الأسلاك في زوايا مختلفة (مثلواحد على التوالي اليسرى، واحد 45 ° وزاوية واحدة) لجعلها مميزة.
4. ملء الأنبوب بالأسلاك، واختيار تباعد مناسب من أقطاب للتجربة (مثلاً، الميدانية المحلية القشرية المحتملة (طابعات الحجم الكبير) والمصدر الحالي الكثافة (CSD) التسجيل، نتوء الموصى به من نصائح الأسلاك من افتتاح الأنبوب: 4.5 مم، 4.1، و 3.7 ملم، على التوالي). ملاحظة الأسلاك التي تناظر فيها عمق للحفاظ على نظام قناة مناسبة.
5. مجرد محاذاة إلى اليمين بجوار بعضها البعض الأسلاك ومتوازية مع الأنبوب، لإصلاح الأسلاك الكهربائي، ضع قطره واحدة من السائل superglue في كلا طرفي الأنبوب بإبرة حادة. تأكد من أن تتدفق الغراء الأنبوب نظراً لتأثير الشعرية، ولكن ليس نحو مواقع التسجيل في نهايات بارزة.
6. تعد هيئة واجهة قطب مع ميكروكونيكتور الصحيحة متوافقة مع نظام التسجيل لاستخدامها.
7. إدخال نهايات الأسلاك غير المسجلة، وبنت في الثقوب المجلس واجهة القطب المقابل للقناة التسجيل المطلوب. عندما تكون جميع الأسلاك في الموقف، ودفع دبابيس ذهبية في الثقوب بالملقط.
   ملاحظة: دبابيس الذهب قد تكون ثابتة في مكانها باستخدام أسمنت الأسنان، ولكن في معظم الحالات، أنها مستقرة بدرجة كافية حتى بدون هذه الخطوة السلامة.

3-التخدير

1. وضع الحيوان في دائرة تحريض تخدير مختومة وملء مع 4-5% إيسوفلوراني في الهواء الطبي 2 لتر في الدقيقة.
2. عند الجرذان راقد، إزالة الحيوان من الدائرة ووضعه في إطار ستيريوتاكسيك مع قطعة آنف تهوية مناسبة.
3. تعيين مستوى isoflurane إلى 2 في المائة، على الرغم من أن معدل تدفق الهواء ينبغي أن تظل كما هي. التحقق من مستوى للتخدير. إذا كان هناك غياب منعكس سحب مخلب ردا على معسر، تستمر، وإلا يزيد عمق التخدير.
4. مراقبة والحفاظ على درجة حرارة الجسم في الفئران في 37 ± 0.5 درجة مئوية مع نظام رصد هوميوثيرميك. تطبيق معالجة تجميعية مرهم البارافين في العينين لمنع جفاف القرنية. كرر هذا الإجراء خلال عملية جراحية عدة مرات، إذا لزم الأمر.
5. تحت الجلد حقن الأتروبين 0.3 مغ/كغ لتجنب تكوين المخاط في الخطوط الجوية. كرر هذا الإجراء كل أربع ساعات في حالة العمليات الجراحية أطول. مراقبة التنفس وضبط المبخر، إذا لزم الأمر.

4-غرس التحفيز وتسجيل كهربائي

ملاحظة: اﻷوتوكﻻف كل ما يلزم الجراحية الصكوك واتباع القواعد العامة أسيبسيس والملاءمة بعناية أثناء الإجراء بأكمله. تجنب لمس المناطق نونستيريلي خارج منطقة العمليات الجراحية. تزج الأقطاب في الكحول الاثيلي (70 في المائة) لمدة 30 دقيقة قبل غرس.

1. إزالة معظم الشعر من فروة الرأس مع ماكينة قص شعر. تطبيق كريم مزيل الشعر في فروة الرأس، وتنتشر بشكل متساو على السطح، وانتظر بضع دقائق. استخدام ملعقة لإزالة بلطف الكريم والشعر المتبقية. يشطف الجلد بالماء، ثم بمطهر.
2. حقن ليدوكائين 1-2% (لا تتجاوز جرعة إجمالية من 7 مغ/كغ) تحت الجلد لتخدير الجلد. تطبيق قطره واحدة من الطبيب البيطري مرهم للعيون (مثلاً، البارافين).
3. جعل دقيق وشق السهمي طويلة (~ 2 سم) في خط الوسط مع مشرط، من الجبين في الرقبة. تشريح الأنسجة بما في ذلك السمحاق من الجمجمة، ثم استخدام الملقط ازميل أو الأسنان تنظيف المنطقة الواقعة بين cristae العظام الصدغي اثنين. الاحتفاظ بالجمجمة كشفها بواسطة تراجعه تشريح الجلد باستخدام لدغ الأربعة.
4. بلطف ضع ملاقط غرامة بين حافة حادة من العظم الصدغي والعضلات وتفصل بينهما. جعل حركات التسوية لفضح كجزء كبير من سطح كبير من العظم الصدغي ممكن، ويفضل أن تكون من حافة عظم قذالي إلى طائرة خيوط coronal، دون إلحاق الضرر بالعضلات.
5. ضع بيتيمبورالي الكامشات للحفاظ على عظام الصدغي مكشوف.
6. شطف سطح الجمجمة مع 1-2 مل 3 ٪ ح₂س_2، ثم يغسل مع 1-2 مل من الماء.
7. أيردري سطح العظام الصدغي بعناية فائقة، والتخلص من الرطوبة بالعصي العين. اختبار ما إذا كان يصلح أقطاب التحفيز على سطح الجمجمة العمودي تنظيفها (يجب أن تكون الحافة العليا للتحفيز الكهربائي تمشيا مع حافة كريستا العظم الصدغي). إعادة ضبط لدغ والكامشات أو تشكيل أقطاب التحفيز مع مقص، إذا لزم الأمر.
8. ملء التجاويف لتحفيز كهربائي مع اليكتروكوندوكتيفي هلام ووضع طبقة رقيقة من الغراء على حافة أقطاب كهربائية.
9. ضع مسرى التحفيز على السطح الجاف للعظم الصدغي مع حركة دقيقة واحدة، وأنه عقد بقوة في المكان لمدة دقيقة واحدة مع ملاقط غرامة. تأكد من أن لا رطوبة على اتصال بالغراء. باتاكا بالعصي العين، إذا لزم الأمر.
   تنبيه: في حالة عدم الاستقرار أي القطب هو من ذوي الخبرة، إزالته. بعد تنظيف العظام، كرر هذه الخطوة مع قطب تحفيز جديدة.
10. وضع الأسمنت الأسنان على حواف مسرى التحفيز، بينما هو جفت الرطوبة تسرب الأنسجة بالعصي العين باستمرار. تغطية مسرى التحفيز كله مع الأسمنت.
11. وبعد تصلب تماما الأسمنت، كرر هذه الخطوات على الجانب كونترالاتيرال.
12. بعض الحفر في جميع أنحاء الجمجمة لترسيخ مسامير. محرك مسامير مصغرة في الثقوب ووضع الأسمنت الأسنان أكثر منهم. استخدام حفر قطرها أصغر ~ 10% الرأس مقارنة بقطر المسمار.
13. تبعاً للغرض من هذه التجارب، لحام موصل إلى نهايات الكابلات، ووضعه على السطح، وتغطي بالأسمنت، أو مواصلة غرس أقطاب تسجيل والألياف الضوئية أو تعد نافذة الجمجمة على الجمجمة. في هذه الحالة الأخيرة، لحام الموصلات وترسيخها للبناء إلا في النهاية. في حالة الحاجة للمدى الطويل المتزامنة تسجيلات قسم التدريب والامتحانات وطابعات الحجم الكبير، زرع توائم القطب المذكور بدلاً من الأسلاك واحد.
    ملاحظة: يسمح هذا الإعداد لإزالة مشترك وضع التحفيز المشغولات الحرفية⁸. للاطلاع على تفاصيل تسجيل زرع قطب كهربائي، راجع البروتوكولات السابقة^14،15.
14. تغسل الأنسجة المعرضة تماما بمطهر. حقن ليدوكائين 1-2% (لا تتجاوز جرعة إجمالية من 7 مغ/كغ) تحت الجلد.
15. ديبريدي حواف الجرح وإغلاقها مع خيوط توقف بسيطة حول الموصل/عملية الزرع. تطهير الجرح مع بوفيدون.
16. حقن 5 ملغ/كغ كاربروفيني تحت الجلد. كرر هذه العملية إذا لزم الأمر.
    ملاحظة: يمكن استخدام أي مسكنات أخرى مطابقة المتطلبات التي حددها المجلس إذن الأخلاقية المحلية.
17. تعليق التخدير والإفراج عن إيربارس ونوسيبيسي، ووضع الحيوان في قفص التعافي بعد العملية الجراحية يستعيد وعيه.
18. التأكد من أن الحيوان تحت إشراف وثيق خلال الساعات الأولى بعد العملية الجراحية. مواصلة رصد منطقة الزرع بشكل دوري.
    ملاحظة: هذا الحيوان لا ينبغي أن تترك غير المراقب حتى قد وعيه كافية للحفاظ على ريكومبينسي القصية. بيت الحيوان على حدة حتى الشفاء التام من الإجراء.

يمكن أن يقترن غرس أقطاب التحفيز المزمن (الشكل 1B) غرس إضافية لتسجيل كهربائي (الشكل 1-د). هذه الإعدادات مناسبة لتشكيل الطلب على تسجيل ونظم التحفيز للتدخل في أنشطة محددة في الدماغ. نقدم هنا نتائج تمثيلية كشف الصرع مغلقة ونظام التدخل، تطبق على الفئران إيفانز طويلة معربا عن المضبوطات عفوية (الشكل 2A)⁹. ومن المعروف هذه السلالة لإظهار أعراض اليكتروجرافيك والسلوكية للصرع غياب (petit مال) (الشكل 2). في حالة الصرع، كما مسجل يتم تحليل إشارات إينتراكورتيكال في الوقت الحقيقي، ومشغل يتم إرسالها إلى مولد حافز معزولة في اللحظة المناسبة للتدخل مع سبايك وموجه نشاط الدماغ. في المقابل، يسلم مولد حافز تهمة متوازنة، حافز ثلاثية الأطوار من خلال أقطاب التحفيز bitemporal بغية وقف النشاط الاستيلاء.

ويبين الشكل 2-د قدرة المحفزات وقتيا المستهدفة المقاطعة مضبوطات الجارية من الأسبوع 1 إلى الأسبوع 16، مما يدل على متانة وموثوقية من أقطاب التحفيز مزروع. لوضع هذه النتائج في سياق، يعرض الشكل 2E التسجيلات من تجربة فاشلة، حيث اخترقت النسيج الثانوي بين العظم الصدغي وسطح قطب كهربائي بسبب الختم غير لائق ووطدت من أقطاب كهربائية (تشريح الجثة أكد الحيوان غزو الأنسجة). بالإضافة إلى زيادة مقاومة أقطاب التحفيز، الأنسجة المتزايدة يرجح أن يوفر تحويله كهربائية. هذه التجربة تبرز أهمية عزل دقيق لتحقيق نتائج يمكن الاعتماد عليها واستنساخه أثناء تجارب التحفيز المطلق.

رقم 1: خطوات لتنشيط وتسجيل تلفيق القطب. أسلاك ملتوية (A) مخيط من خلال الثقوب وثابتة للتعبئة والتغليف قبل التفاف الأسلاك مقشرة في التجاويف. (ب) الشكل النهائي لأقطاب التحفيز. داخلي: التفاف الأسلاك داخل العبوة؛ (ج) الجانب أعرض من أقطاب تسجيل؛ (د) عرض أعلى من أقطاب تسجيل. اقحم: نصيحة مواقع التسجيل، 400 ميكرون التباعد. (ه) الصورة الموضعية لإيداع الكهربائي transcranial التحفيز. الفعل مزروع أقطاب التحفيز، جنبا إلى جنب مع بعض من المسامير ترسيخ. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 2: نتائج تمثيلية للتدخل الاستيلاء على حلقة مغلقة باستخدام أقطاب التحفيز لهذا البروتوكول- (أ) نظرة عامة على نظام حلقة مغلقة. يتم زرعها أقطاب تسجيل الثلاثي في القشرة الجدارية ويتم وضع أقطاب التحفيز بيتيمبورالي في الجمجمة. مزودة بمكبر للصوت على رأس الفئران ومتصلة بنظام الكشف عن مصادرة في الوقت الحقيقي. (ب) طابعات الحجم الكبير تتبع آثار "المثال طابعات الحجم الكبير" دون انقطاع الاستيلاء سبايك والموجه (C و D) الاستيلاء على التدخل في 1^st والأسبوع^ال 16 من التحفيز. (ﻫ) مثال على فشل الاستيلاء على انقطاع في حالة الأنسجة المتنامية بين أقطاب التحفيز والعظم الصدغي (المؤكدة بتشريح الجثة) الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

أن الخطوة الأكثر أهمية من هذا البروتوكول هو الالتصاق من الحزمة الكهربائي على سطح العظم. في حالة إغلاق غير لائق، تتشكل فجوة بين الأقطاب والعظام، وندبا الثانوية يمكن أن تنمو لتصبح هذه الفجوة، مما يقلل من الجودة للتحفيز. يجب أن يكون سطح العظام جافة تماما خلال خطوات الشائكة على الحزمة، وفي حالة تعاني من عدم الاستقرار للأقطاب، فإنه يجب أن تكون إزالته واستبداله بحزمة جديدة للحصول على أفضل النتائج.

حد لهذا الأسلوب أن كما لم يتم إغلاق الجلد تماما بعد عملية جراحية، هناك مخاطر أكبر نسبيا للإصابة. الرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية في أول 4-5 أيام أثناء الاسترداد بمحلول مطهر، وفي وقت لاحق مع مسحوق، يساعد على منع العدوى. ويسهل هذا العلاج في تجربتنا، تشكيل ندبا، مما يمكن تماما لإغلاق الجرح تجاه العالم الخارجي.

هنا قدمنا أحد أساليب أرخص، والتي يسهل الوصول إليها من تلفيق القطب، ولكن تبعاً للاحتياجات الخاصة لتجارب معينة، قد يلزم تعديل مواد موصلة، مثلاً، طلاء سطح الكابلات مع غير الاستقطاب الكهربائي واجهة المواد، مثلاً، PEDOT:PSS. يمكن أن تكون الحزمة القطب مصنوعة خصيصا وطباعة 3D وتعديله قبل المجربون، توصياتنا لا تطابق متطلبات دراسة خاصة في القضية. في تجربتنا، حجم الأقطاب transcranial ملفقة في هذه الدراسة تسمح عللها في الفئران الذكور والإناث على حد سواء أعلاه 300 غرام من وزن الجسم، ولكن يمكن بسهولة تخفيض حجم أقطاب التحفيز بقطع شرائح أصغر في البروتوكول خطوة 1.3. علاوة على ذلك، يمكن استبدال جميع الغراء وطب الأسنان والأسمنت في البروتوكول مع البدائل، وبالنظر إلى أن الطبقة الخارجية في الاتصال المباشر مع الأنسجة، ولذلك ينبغي أن تكون الحيوية المتوافقة.

في هذه الدراسة، قدمنا بروتوكول bitemporal التحفيز الكهربائي تلفيق وغرس، ومن الناحية التقنية البسيطة لأداء وفعالة من حيث التكلفة وموثوق بها على المدى الطويل، السماح بتجارب التحفيز الكهربائي على بحرية تتحرك الفئران⁹. كما يتم وضع أقطاب التحفيز على العظم الصدغي، هو الحفاظ على سطح أفقي كامل الجمجمة لأخرى عللها. هذا الأسلوب يمكن أن تكون جنبا إلى جنب مع الكهربية العادية^15،16،¹⁷من أوبتوجينيتيك، والتصوير تقنيات¹⁸ ، توفير إمكانية تركيبة متعددة البروتوكولات التجريبية.