Summary

Использование синаптических цинка гистохимии выявить различные регионы и пластинки в развивающихся, так и взрослого мозга

Published: October 29, 2017
doi:

Summary

Мы описываем гистохимические процедуру, которая раскрывает характерные ламинарное и площадных цинка, окрашивания моделей в различных мозга. Цинк окрашивание шаблон может использоваться в сочетании с другими анатомические маркерами надежно различать слои и регионах в развивающихся, так и взрослого мозга.

Abstract

Характеристика мозга анатомической и функциональной организации и развития требует точной идентификации различных нейронных цепей и регионов в незрелых и взрослого мозга. Здесь мы описываем цинка гистохимические пятная процедуру, которая показывает различия в окрашивания моделей среди различных слоев и мозга. Другие использовали эту процедуру не только выявить распределения цинка содержащих нейронов и цепей в головном мозге, но и успешно очертить границы ареала и ламинарные в развивающихся, так и взрослого мозга в нескольких видов. Здесь мы показываем это пятная процедуру с изображениями из развивающихся и взрослого хорька мозги. Мы раскрыть шаблон окрашивание цинка, который служит в качестве анатомического маркера областей и слои и надежно может использоваться для различения визуальные корковых областях в развивающихся, так и взрослых зрительной коры. Основная цель настоящего Протокола заключается в представлении гистохимический метод, который позволяет точное выявление слоев и регионов в развивающихся, так и взрослого мозга, где другие методы не позволяют сделать это. Во-вторых в сочетании с анализом денситометрических изображений, этот метод позволяет оценить распределение синаптических цинка выявить потенциальные изменения на протяжении развития. Этот протокол описывает подробно реагентов, инструменты и шаги, необходимые для последовательно пятно замороженный мозг секций. Хотя этот Протокол описан с помощью хорька мозговой ткани, она может быть легко адаптирована для использования в грызунов, кошки или обезьян также, как и в других регионах мозга.

Introduction

Гистологические пятна традиционно использовались для оказания помощи в идентификации корковых областях в различных видов путем выявления различий в архитектурные особенности. Комбинированное использование гистохимические методы, такие как Ниссль вещество, реактивность цитохрома-оксидазы (CO) или миелина может оказаться плодотворным, как они показывают аналогичные площадной границ в взрослого мозга. Однако эти гистохимические пятна не всегда должным образом выявить четких границ между корковых областях и слоев в незрелых мозга.

В центральной нервной системе цинк имеет несколько важных функций, которые включают стабилизации структуры ДНК, действуя как кофактор фермента, участвуя в многочисленных нормативных функций и действуя в качестве нейромодулятора через свое присутствие в синаптических пузырьков 1. синаптических цинка является уникальной, поскольку она могут быть визуализированы с помощью гистологических методов, в то время как белок прыгните цинка не может быть визуализирован2. Эта возможность была использована раскрыть структуре синаптических цинка в различных регионах корковых и синаптической цинка гистохимии использовалась в ряде исследований. Подмножество глутаматергические нейронов коры головного мозга содержат цинка в пресинаптическом везикулы в пределах их аксона терминалы3,4. Гистохимических исследований показали гетерогенных распределение синаптических цинка в коре5,6,7. Там, как представляется, различные площадной и ламинарные распределения методами реагирования цинка в различных регионах кортикального слоя (например, визуальный против соматосенсорной коры), или слоев (например, уровни цинка в supragranular и infragranular слои первичной зрительной коры значительно выше, чем в thalamocortical входного слоя IV с относительно низкой синаптических цинка уровнями)5,8,9. Гетерогенность в синаптических цинка окрашивание, наблюдается в коре особенно выгодно, как она содействует идентификации площадной и слоистые.

Здесь мы представляем подробное описание синаптических цинка гистохимические процедуры, которая представляет собой модифицированную версию Danscher в 1982 году метод10. Этот метод использует селенит вводили внутрибрюшинно (IP) в животных как комплексон. Селенит едет в мозг реагировать с бассейнами свободной цинка, найденных в везикулы подмножество глутаматергические синапсов в головном мозге. Эта реакция дает осадок, который может впоследствии дополняться Серебряный развития2,10,11.

Эта процедура показывает ламинарное и площадных модели синаптической цинка окрашивания; денситометрических анализ может использоваться для оценки этих моделей как качественно, так и количественно в мозге взрослого и незрелых для изучения воздействия других мероприятий, таких как сенсорные, экологические, фармакологическим или генетических манипуляций. Кроме того один может потребоваться оценить потенциал развития изменения в распределении синаптических цинка в других корковых и подкорковых структур в других системах модель. Количественная информация, предоставляющий денситометрических анализ в этот метод может быть выгодным для развития мозга со временем. Этот протокол обеспечивает компаньон для других иммуно – и гистохимических маркеры раскрыть ламинарное и площадных границ.

Protocol

следующий протокол следует животных ухода руководящими принципами, установленными на институциональный уход за животными и использования Комитет (IACUC) в колледже Нью-Йорка, которые соответствуют все соответствующие государственные и федеральные руководящие принципы. Анестезия для ?…

Representative Results

В блок-схема на рисунке 1представлены основные шаги, участвующих в настоящем Протоколе пятно мозга разделы для синаптических цинка. Протокол можно разделить на три этапа: 1) перфузии и коллекции тканей, подготовка 2) тканей и окрашивание и гистохимии 3) ц?…

Discussion

Настоящее исследование использует гистохимический метод, основанный на модифицированную версию Danscher (1982) метод10, whereby синаптических цинка локализации могут быть обнаружены и визуализирована в головном мозге. Этот метод по сути работает путем инъекций животное с цинка сел…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана субсидии от национального центра для исследования ресурсов (2G12RR03060-26A1); Национальный институт здоровья меньшинств и неравенства в области здравоохранения (8G12MD007603-27) от национальных институтов здоровья; Профессиональный персонал конгресс Сити университета Нью-Йорка (PSC-CUNY); и факультет исследований Грант (ФРГ II) американский университет в Шардже. Мы благодарим Видьясагар Sriramoju за представление нам этих методов.

Materials

Euthasol (Euthanasia solution) Henry Schein 710101
Sodium selenite Sigma-Aldrich 214485
Ketamine (Ketaved) Henry Schein 48858 100 mg/ml injectables
Xylazine (Anased) Henry Schein 33198 100 mg/ml injectables
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich F8775 Dilute to 4%
Gum arabic Sigma-Aldrich G9752-500G
Citric acid Sigma-Aldrich C1909
Sodium citrate Sigma-Aldrich W302600
Hydroquinone Sigma-Aldrich H9003
Silver lactate Sigma-Aldrich 85210
Fish gelatine Sigma-Aldrich G7765
Cytochrome c Sigma-Aldrich C2506 (Type III, from equine heart)
Catalse Sigma-Aldrich C10
Sucrose Domino
Xylene Fisher Scientific X5P-1GAL
Permount Fisher Scientific SP15-500
100% Ethanol Fisher Scientific A406-20 Used for dehydration prior to slide mounting
Coverslips Brain Research Laboratories #3660-1
Frosted unsubbed slides Brain Research Laboratories #3875-FR
Microtome American Optical Company 860
Microscope Olympus BX-60
Adope Photoshop Adobe Systems, San Jose, CA To assemble images
ImageJ Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/ For densometric measurements
Plastic tray Any standard plastic tray may be used to immerse slides in developer solution
Hot plate Any standard hotplate may be used

Referenzen

  1. Nakashima, A., Dyck, R. H. Zinc and cortical plasticity. Brain Res. Rev. 59, 347-373 (2009).
  2. Frederickson, C. J. Neurobiology of zinc and zinc-containing neurons. Int Rev Neurobiol. 31, 145-238 (1989).
  3. Beaulieu, C., Dyck, R., Cynader, M. Enrichment of glutamate in zinc-containing terminals of the cat visual cortex. NeuroReport. 3 (10), 861-864 (1992).
  4. Martinez-Guijarro, F. J., Soriano, E., Del Rio, J. A., Lopez-Garcia, C. Zinc-positive boutons in the cerebral cortex of lizards show glutamate immunoreactivity. J Neurocytol. 20 (10), 834-843 (1991).
  5. Dyck, R., Beaulieu, C., Cynader, M. Histochemical localization of synaptic zinc in the developing cat visual cortex. J Comp Neurol. 329 (1), 53-67 (1993).
  6. Garrett, B., Geneser, F. A., Slomianka, L. Distribution of acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the mouse. Anat Embryol. (Berl). 184 (5), 461-468 (1991).
  7. Garrett, B., Osterballe, R., Slomianka, L., Geneser, F. A. Cytoarchitecture and staining for acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the Parma wallaby (Macropus parma). Brain Behav Evol. 43 (3), 162-172 (1994).
  8. Dyck, R., Cynader, M. An interdigitated columnar mosaic of cytochrome oxidase, zinc, and neurotransmitter-related molecules in cat and monkey visual cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. (90), 9066-9069 (1993).
  9. Land, P. W., Akhtar, N. D. Experience-dependent alteration of synaptic zinc in rat somatosensory barrel cortex. Somatosens Mot Res. 16 (2), 139-150 (1999).
  10. Danscher, G. Exogenous selenium in the brain: a histochemical technique for light and electron microscopic localization of catalytic selenium bonds. Histochemistry. 76, 281-293 (1982).
  11. Danscher, G., Howell, G., Perez-Clausell, J., Hertel, N. The dithizone, Timm’s sulphide silver and the selenium methods demonstrate a chelatable pool of zinc in CNS: a proton activation (PIXE) analysis of carbon tetrachloride extracts from rat brains and spinal cords intravitall treated with dithizone. Histochemistry. 83, 419-422 (1985).
  12. Gallyas, F. Silver staining of myelin by means of physical development. Neurol Res. 1 (2), 203-209 (1979).
  13. Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
  14. Miró-Bernié, N., Ichinohe, N., Perez-Clausell, J., Rockland, K. S. Zinc-rich transient vertical modules in the rat retrosplenial cortex during postnatal development. J Neurosci. 138 (2), 523-535 (2006).
  15. Ichinohe, N., Rockland, K. S. Distribution of synaptic zinc in the macaque monkey amygdala. J Comp Neurol. 489 (2), 135-147 (2005).
  16. Innocenti, G. M., Manger, P. R., Masiello, I., Colin, I., Tettoni, L. Architecture and callosal connections of visual areas 17, 18, 19 and 21 in the ferret (Mustela putorius). Cereb Cortex. 12 (4), 411-422 (2002).
  17. Khalil, R., Levitt, J. B. Zinc histochemistry reveals circuit refinement and distinguishes visual areas in the developing ferret cerebral cortex. Brain Struct Funct. 218, 1293-1306 (2013).
  18. Manger, P. R., Masiello, I., Innocenti, G. M. Areal organization of the posterior parietal cortex of the ferret (Mustela putorius). Cereb Cortex. 12, 1280-1297 (2002).
  19. Wong, P., Kaas, J. H. Architectonic subdivisions of neocortex in the gray squirrel (Sciurus carolinensis.). The anatomical record. 291, 1301-1333 (2008).
  20. Land, P. W., Shamalla-Hannah, L. Experience-dependent plasticity of zinc-containing cortical circuits during a critical period of postnatal development. J Comp Neurol. 447 (1), 43-56 (2002).
  21. Czupryn, A., Skangiel-Kramska, J. Distribution of synaptic zinc in the developing mouse somatosensory barrel cortex. J Comp Neurol. 386, 652-660 (1997).
  22. Timm, F. Zur Histochemie der Schwermetalle. Das Sulfid-Silber-Verfahren. Dtsch Z ges gerichtl Med. 46, 706-711 (1958).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Khalil, R., Levitt, J. B. Use of Synaptic Zinc Histochemistry to Reveal Different Regions and Laminae in the Developing and Adult Brain. J. Vis. Exp. (128), e56547, doi:10.3791/56547 (2017).

View Video