AFM e Microrheology nella cella tuorlo embrione di pesce zebra

I principi fisici alla base del controllo biomeccanico di processi morfogenetici sono in gran parte indefiniti. Mentre studi biomeccanici a livello molecolare e cellulare stanno raccogliendo un considerevole slancio, l’esplorazione dei parametri biomeccanici a livello del tessuto/organismo è a sua infanzia. Idrodinamica regressione¹ o Video microscopia di forza² permettono ai ricercatori di distinguere le forze attive e passive, mentre laser microchirurgia³o la microscopia a forza atomica (AFM) meno intrusiva di cellule dissociate⁴ o in vivo ⁵ o nanoparticelle microrheology⁶ consentire l’anticipazione di un tessuto proprietà meccaniche e le risposte.

AFM è una tecnica topografica tridimensionale con risoluzione atomica ad alta risoluzione di rugosità superficiale e rispetto dalla deflessione di suggerimenti a sbalzo a contatto con una superficie sondati⁷. Diverse metodologie che impiegano AFM sono stati sviluppati per studiare proprietà di superficie, compresa la misurazione di attrito, le forze di adesione e proprietà viscoelastiche dei materiali diversi. Recentemente, AFM è emerso come un potente strumento per recuperare le informazioni sulle proprietà meccaniche dei campioni biologici. In particolare, AFM non invadente può estrarre il modulo di taglio complesse da singole cellule applicando oscillatori rientranze con un micro suggerimento attaccato a uno sbalzo di noto curvatura costante⁸. Questo ci permette di dedurre le forze risultanti. Eppure, AFM non è univoco e diverse metodologie consentono di estrarre dati reologici e proprietà meccaniche da singole celle (ad esempio, micropipetta aspirazione⁹, magnetico torsione cytometry (MTC)¹⁰o uniassiale trazione test¹¹).

Ancora, l’applicazione di queste nuove metodologie a complessi processi morfogenetici non è semplice. Le sfide principali affrontate nel determinare le proprietà meccaniche dei tessuti embrionali sono il piccolo (µm a mm), morbido (nel 10² – 10⁴ Pa gamma) e natura visco-elastico (dando luogo a fenomeni dipendenti dal tempo) del materiale¹². È pertanto importante adeguare i metodi impiegati per la determinazione delle proprietà meccaniche (rigidezza, viscosità, adesione) per il caso specifico di embrioni e di organismi in via di sviluppo. Due questioni importanti devono essere prese in considerazione quando si analizzano reologici approcci nello studio dello sviluppo: per evitare interferenze invadente e per fornire facile accessibilità. In questo scenario, l’aspirazione micropipetta, MTC e prove di trazione presentano limitazioni. Nel primo caso, all’elevata deformabilità che soffre di una cella potrebbe alterare le proprietà fisiologiche e meccaniche⁹. Nel secondo caso, la necessità di aderire saldamente al tessuto sperimentale di un substrato per garantire che le sollecitazioni impresse deformano il citoscheletro localmente potrebbe anche introdurre effetti sullo stato di attivazione delle cellule e, quindi, nelle loro caratteristiche meccaniche¹⁰ . Approcci di trazione monoassiali, ultimi sono limitati dalla geometria di sviluppare organismi e accessibilit๹.

AFM sembra essere più adatto per lo studio dei processi di sviluppo in quanto permette lo studio di campioni biologici direttamente nel loro ambiente naturale senza alcuna preparazione del campione ingombrante. Inoltre, come dissociazione di tessuti embrionali è generalmente difficile, la ridotta dimensione delle sonde AFM fornisce un alto grado di versatilità con nessuna limitazione nella scelta del tipo di media (acquoso o non acquoso), la temperatura del campione o prodotto chimico composizione del campione. AFM è abbastanza versatile per essere applicato a domini di grandi dimensioni e scale del tempo ed è stato impiegato per recuperare le proprietà materiali dei tessuti in condizioni fisiologiche o distinte fasi di sviluppo. Tessuti intero nativi come arterie¹³ o ossa¹⁴ sono state studiate dal punto di vista topografico e in alcuni casi, come la sclera, proprietà meccaniche sono stati anche estratto¹⁵. Topografia è stato esplorato anche in streaming in embrioni permettendo la visualizzazione di, per esempio, la riorganizzazione a cellula durante la morfogenesi in Xenopus¹⁶. Protocolli della preparazione del campione globale, ultimo sono state sviluppate per determinare i parametri meccanici durante diversi processi di sviluppo. La nanoindentazione mappe sono state generate su sezioni di tessuto nativo non fissati per il pulcino embrionali digerente¹¹; Proprietà adesive e meccaniche estratto per le singole celle di ectoderma, mesoderma ed endoderma progenitrici isolate da gastrulating zebrafish embrioni⁴; misurazioni di rigidità per l’epiblasto e linea primitiva su espianti da embrioni aviari¹⁷; e un modello distinto di gradienti di rigidità sono definiti direttamente nel cervello embrionale di Xenopus⁵.

Un salto di qualità notevole per l’applicazione di AFM per esplorare lo sviluppo embrionale può venire da avvicinando semplici accessibili processi morfogenetici. Epiboly di zebrafish è un evento essenziale e conservato, in cui diversi tessuti coordinano in uno spazio ristretto sferico per dirigere l’espansione del blastoderm in poche ore. Al momento della comparsa di zebrafish epiboly (fase sferica), uno strato superficiale di cellule, lo strato avvolgente (EVL), copre una calotta semi-sferica di blastomeri centrata sul polo animale dell’embrione che si siede su una cellula sinciziale tuorlo massiccia. Epiboly consiste dell’espansione corticale ward vegetale dell’EVL, cellule profonde (DCs) il blastoderm, e lo strato esterno della cellula sinciziale tuorlo (E-YSL) intorno al tuorlo. Epiboly si conclude con la chiusura dell’EVL e i controller di dominio al palo vegetal^18,19,20. Come e dove le forze sono generate durante epiboly e come sono accoppiate a livello globale non è ancora chiaro^1,21.

Qui descriviamo in dettaglio come applicare AFM per dedurre proprietà meccanica passiva del tessuto durante la progressione di epiboly in zebrafish tuorlo delle cellule in vivo. A tale scopo, abbiamo impiegato le piccole microsfere attaccate al cantilever AFM come sonde. Questo consente il recupero di informazioni locale precise all’interno della superficie delle cellule di tuorlo non uniforme e di studiare tensionale gradienti e le loro dinamiche nel tempo. Si avvicina a AFM alternativi come quelli che usano Cuneo cantilever²², saranno dati locali non rendering che sono sufficientemente precisi. La tecnica di Cuneo, che richiede le abilità di manipolazione molto attenta ad incollare una fetta più grande della dimensione del campione all’estremità del cantilever, non è adatta per il sondaggio dell’embrione (~ 2 volte più grande rispetto alla lunghezza dello sbalzo) meccanica.

Modellazione e caratterizzare le proprietà viscoelastiche delle cellule in modo qualitativo e quantitativo consente una migliore comprensione dei loro biomeccanica. Da un punto di vista biomeccanico, è essenziale comprendere epiboly e non solo richiesta conoscenza sulle misurazioni di tensione corticale e dinamiche, che possono essere estratti da AFM; così c’è bisogno di informazioni sulle proprietà biofisiche del tessuto. Per estrarre queste informazioni, una varietà di cellula reologia tecniche sono state sviluppate nel corso degli anni al fine di caratterizzare i diversi tipi di cellule sotto diverse condizioni fisiologiche²³. Essi includono AFM, MTC e pinzette ottiche (OT). Questi metodi, tuttavia, sono stati dimostrati inadeguati per mesoscopiche analisi a scala di embrioni o di organi. In alternativa, abbiamo adattato con successo nanoparticle tracking microrheology⁶ per in vivo misure reologiche. Questa tecnica analizza gli spostamenti browniani delle singole particelle e vengono dedotte le proprietà locali micromeccanici.

Insieme microrheology AFM e nanoparticelle consentono la definizione delle dinamiche tensionale corticale e proprietà meccaniche interne del tuorlo durante epiboly. Queste informazioni approva pienamente un modello in cui anisotropo stress si sviluppa in conseguenza delle differenze nella risposta deformazione dell’EVL e strato citoplasmico tuorlo (YCL) alla contrazione di actomiosina isotropo della corteccia E-YSL è essenziale per il movimento netto direzionale della progressione EVL ed epiboly¹.