原子間力顕微鏡とゼブラフィッシュ胚の卵黄細胞のレオロジー
Summary
材料特性と体内張力パラメーターを測定するツールの欠如は、開発中に自分の役割を検証するを防ぎます。原子間力顕微鏡 (AFM) とふせ中そのままゼブラフィッシュ胚の卵黄細胞の機械的な機能を定量化するナノ粒子の追跡を採用しました。これらのメソッドは、信頼性が高く、広く適用できる侵入の介入を避けることです。
Abstract
組織の進化の時空間的組織に直接因子の解明は、開発の研究の主な目的の 1 つです。さまざまな命題は、異なる発達と形成過程における時空間組織の細胞や組織の機械的性質の理解に重要な貢献をされていると主張します。ただし、材料特性と体内張力パラメーターを測定する信頼性とアクセス ツールの不足、これらの仮説の検証は困難でした。原子間力顕微鏡 (AFM) と粒子追跡ふせ中にそのままゼブラフィッシュ胚の卵黄細胞の機械的性質を数値化の目的と方法をご紹介します。ふせはその研究は胚の透明性によって促進される保存の初期発達過程です。これらのメソッドが実装する単純な信頼性、および広く適用以来、彼らは組織の力学に影響を与えることができる侵入の介入を克服します。単純な戦略は、標本、AFM 記録、およびナノ粒子注入の取り付けと追跡の適用されました。このアプローチでは、これらのメソッドは他の発達度や生物に容易に適応になります。
Introduction
地形形成過程の力学的制御の基になる物理的な原則は、主として定義されていません。分子・細胞レベルの生体力学的研究がかなりの勢いを収集している組織・個体レベルでの生体力学的パラメーターの探査はその初期の段階で。流体の回帰1またはビデオ力顕微鏡2レーザー顕微鏡3、または解離細胞4のより少なく嵌入的原子間力顕微鏡 (AFM) 中のアクティブおよびパッシブ力を区別するために研究者を許可するまたは生体内で5やナノ粒子のマイクロレオロジー簡易6組織の力学的特性と応答の期待を許可します。
原子間力顕微鏡、表面粗さ、接触時に片持ち梁先端の変形からのプローブ表面7遵守の解決高原子分解能三次元地形手法です。原子間力顕微鏡を用いた異なる方法論は、摩擦、接着力、多様な材料の粘弾性特性の測定を含む表面の特性を調査するために開発されています。最近、原子間力顕微鏡は、試料の物性に関する情報を取得する強力なツールとして浮上しています。特に、原子間力顕微鏡の単一セルから知られている曲げ定数8のカンチレバーに接続されているマイクロ チップの振動のインデントを適用することによって複素すり弾性率抽出できます非侵襲的。これにより生じる力を推測できます。しかし、AFM は一意ではありません、異なる方法論は個々 の細胞からレオロジー データと機械的性質を抽出できるように (例えば、マイクロ ピペット吸引9、ねじれフローサイトメトリー (MTC)10、磁気または一軸引張11をのテスト)。
まだ、これらの新規方法論の複雑な地形形成過程への応用は簡単ではありません。萌芽期ティッシュの機械的性質を決定する際に直面する主要な課題、ソフト (mm μ m)、小 (102 – 104 Pa 範囲) と粘弾性 (時間依存現象に上昇を与えている) 自然素材12。したがって、胚や発展途上の生物の特定のケースに機械的性質 (剛性、粘度、接着性) の定量手法を適応する重要です。2 つの重要な問題が研究開発にレオロジー的アプローチを分析する際に考慮取られる必要: 侵入の干渉を避けるために、簡単にアクセスを提供します。このシナリオではマイクロ ピペット吸引、MTC、および引張試験は、制限を表わします。最初のケースでは、セルに苦しむ高変形はその生理学的・機械的性質9を変更可能性があります。2 番目のケースで適用応力がローカルの骨格を変形させるように基板に実験的組織を堅持する必要可能性がありますも細胞のアクティブ化の状態と、それ故に、機械的な機能10代で効果をご紹介.最後に、一軸引張アプローチは生物とアクセシビリティ11開発の幾何学によって限られます。
原子間力顕微鏡は、ことができます面倒なサンプル準備もせず、自然の環境で直接試料の研究発達過程の研究に適しているようです。さらに、萌芽期ティッシュの解離は一般的に困難である、原子間力顕微鏡プローブの縮小サイズ、メディア (水溶液や非水溶媒)、サンプル温度または化学の種類の選択の制限で汎用性の高いサンプルの組成物。原子間力顕微鏡は、大規模なドメインに適用され、時間スケールに十分な汎用性発達段階や生理的条件で組織の材料特性を取得するために採用されています。全くネイティブ組織機械的性質も取得した15されて動脈13または骨14は地形のポイントのビューから、強のようないくつかのケースで研究されているようです。地形は、アフリカツメガエル16の形態形成における細胞の配列などの視覚化を許可する生きている胚で検討されています。最後に、包括的なサンプル準備のプロトコルは、異なる発達過程における力学的パラメーターを決定する開発されています。ニワトリ胚の消化管11; ネイティブ非固定ティッシュ セクションのナノインデンテーション マップが生成されています。gastrulating ゼブラフィッシュ胚4; から分離された個々 の外胚葉、中胚葉、内胚葉前駆細胞の接着性と機械的性質を取得胚盤葉上層と鳥類胚17から植に原始線条の剛性測定アフリカツメガエル5の胎生期脳で直接定義されている剛性勾配の異なるパターン。
萌芽期の開発を探索する AFM を適用するため大幅な質的な飛躍は、簡単なアクセス可能な地形形成過程に近づいてから来るかもしれない。ゼブラフィッシュふせは不可欠であり、保存されたイベントは、さまざまな組織が、数時間で、胚の拡張を直接に制限された球状空間で調整。ゼブラフィッシュふせ (球面ステージ) の発症時は、包み込むレイヤー (EVL)、細胞の表層は大規模な卵黄の合胞体細胞の上に座って胚の動物極を中心とした割球の半球形キャップをカバーしています。ふせは、EVL、皮質植物区拡大の奥の細胞 (DCs)、胚と卵黄の周り合胞体卵黄細胞 (E YSL) の外部の層で構成されています。ふせ、EVL、植物極18,19,20DCs の閉鎖を終了します。方法と場所ふせ中に生じるし、どのように彼らは大域結合が明確ではない1,21。
ここで詳細にゼブラフィッシュ卵黄でふせ進行中に受動的な機械的組織プロパティが生体内で細胞を推論する AFM を適用する方法を示します。これを行うには、AFM カンチレバー プローブのように接続されている小さな微粒子を採用しました。これは非一様卵黄細胞表面での張力勾配とそのダイナミクスを時間をかけて勉強するに正確なローカルの情報の検索をことができます。代替 AFM アプローチ ウェッジ カンチレバー22を使用するものなど、ないローカルなレンダリング データも正確に。カンチレバーの終わりにサンプル サイズより大きいくさびを接着剤に非常に慎重に操作スキルが必要、くさびのテクニックは胚をプロービングのため適していません (~ 倍カンチレバーの長さより大きい) 力学。
モデリングと定性的および定量的な方法で細胞の粘弾性特性を特徴付ける、バイオメカニクスの改善された理解が可能です。生体力学的視点からそれは、ふせと張力測定と力学、原子間力顕微鏡; で抽出することができますだけでなく需要知識を理解しておく必要従って組織の生物物理学的特性に関する情報の必要性があります。この情報を抽出するには、23さまざまな生理学的な条件の下で種類の異なる細胞を特徴付けるために長年にわたってさまざまな細胞レオロジー技術きた。原子間力顕微鏡には、MTC、光ピンセット (OT) が含まれます。これらのメソッドは、ただし、証明されている胚または器官のスケールで解析は不十分。代わりに、我々 は正常に体内のレオロジー測定用ナノ粒子追跡マイクロレオロジー簡易6を適応しています。この手法は、個々 の粒子のブラウン運動の変位を分析し、ローカル マイクロメカニックス プロパティを推測します。
一緒に原子間力顕微鏡とナノ粒子のレオロジーは、ふせ時に皮質の引張力学の定義と卵黄の内部の機械的性質を許可します。この情報は、完全に、EVL の変形応答の相違の結果として成長する異方性応力 E YSL 皮質の等方性アクトミオシン収縮する卵黄細胞質層 (YCL) は欠かせないモデルを支持します。EVL とふせの進行1の方向の正味の移動。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで、ふせ中ゼブラフィッシュ卵黄細胞のいくつかの生体力学的パラメーターと材料特性容易に推定できるナノ粒子と AFM レオロジーで紹介します。
AFM が生理的条件4,5,25,28の細胞や組織のレオロジー機能を取得するために採用されている、我々 が原子間力顕微鏡をそのま?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
これらのプロトコルのための基礎を設定するのに参加している、Amayra · エルナンデス ベガとフィリップ ・ アレクサンドル ・ Pouille に感謝します。我々 はまた、IBMB PCB、ザビエル ・ エステバン、継続的な支援のための研究室のメンバーから分子イメージング プラットフォームを感謝します。ジャナラリター ・ デ ・ カタルーニャ、DGI と EMB と DN に経済産業省、競争のスペインから Consolider 助成金の連結グループ プログラムはこの仕事を支えた。
Materials
| Inverted optical microscope | Nikon | TE2000 | Visualization of the sample and AFM cantilever |
| Atomic force microscope (AFM) | Custom made | – | Any commercialized AFM could be employed |
| Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM780 | Nanorheology data collection |
| Agarose D1 Low EEO | Conda | 8016.00 | Casting embryos |
| Ultrapure LMP Agarose (low melting) | Invitrogen | 16520-100 | Securing embryos |
| Zebrafish Microinjection and Transplantation Molds | World Precision Instruments | Z-MOLDS | Casting embryos. Custom made with the original dimensions can also be employed |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter |
| Si3N4 cantilever | Novascan | PT.GS | Measuring the embryo by AFM. Spherical tip: 4.5 µm diameter and k=0.01 N/m |
| Fluorescent nanoparticles | Life Technologies | FluoSpheres F8811, | For tracking nanorheology |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | Fabricating tailored microneedles |
| Borosilicate capillary glass | Warner Instruments | G100TF-4 | Fabricating tailored microneedles |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | Manipulating the micropipette |
| Microinjector | Eppendorf | FemtoJet Express | Controlling injection time and pressure |
| Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the embryos during injection |
| Analysis Software | MathWorks | Matlab | Analyzing AFM and particle tracking data |
| Zebrafish | AB and TL wild type | – | Strains employed for embryo collection |
| Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting embryos for nanorheology data collection |
| Stage micrometer | FST | 29025-02 |
Referenzen
- Hernandez-Vega, A., et al. Polarized cortical tension drives zebrafish epiboly movements. EMBO J. 36, 25-41 (2017).
- Brodland, G. W., et al. Video force microscopy reveals the mechanics of ventral furrow invagination in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 22111-22116 (2010).
- Grill, S. W. Growing up is stressful: biophysical laws of morphogenesis. Curr Opin Genet Dev. 21, 647-652 (2011).
- Krieg, M., et al. Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish. Nat Cell Biol. 10, 429-436 (2008).
- Koser, D. E., et al. Mechanosensing is critical for axon growth in the developing brain. Nat Neurosci. 19, 1592-1598 (2016).
- Wirtz, D. Particle-tracking microrheology of living cells: principles and applications. Annu Rev Biophys. 38, 301-326 (2009).
- de Pablo, P. J., Carrión-Vázquez, M. Imaging Biological Samples with Atomic Force Microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2014, 167-177 (2014).
- Roca-Cusachs, P., et al. Rheology of passive and adhesion-activated neutrophils probed by atomic force microscopy. Biophys J. 91, 3508-3518 (2006).
- Evans, E., Yeung, A. Apparent viscosity and cortical tension of blood granulocytes determined by micropipet aspiration. Biophys J. 56, 151-160 (1989).
- Fabry, B., et al. Time scale and other invariants of integrative mechanical behavior in living cells. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 68, 041914 (2003).
- Kashef, J., Franz, C. M. Quantitative methods for analyzing cell-cell adhesion in development. Dev Biol. 401, 165-174 (2015).
- Chevalier, N. R., et al. Measuring the micromechanical properties of embryonic tissues. Methods. 94, 120-128 (2016).
- Reichlin, T., et al. Investigating native coronary artery endothelium in situ and in cell culture by scanning force microscopy. J Struct Biol. 152, 52-63 (2005).
- Rho, J. Y., Tsui, T. Y., Pharr, G. M. Elastic properties of osteon and trabecular bone measured by nanoindentation. J Biomech. 31, 21 (1998).
- Grant, C. A., et al. Surface characterisation and biomechanical analysis of the sclera by atomic force microscopy. J Mech Behav Biomed Mat. 4, 535-540 (2011).
- Efremov, Y. M., et al. Atomic force microscopy of living and fixed Xenopus laevis embryos. Micron. 42, 840-852 (2011).
- Henkels, J., et al. Spatiotemporal Mechanical Variation Reveals Critical Role for Rho Kinase During Primitive Streak Morphogenesis. Ann Biomed Eng. 41, 421-432 (2013).
- Solnica-Krezel, L. Gastrulation in zebrafish — all just about adhesion?. Curr Opin Genet Dev. 16, 433-441 (2006).
- Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Rohde, L. A., Heisenberg, C. P. Zebrafish gastrulation: cell movements, signals, and mechanisms. Int Rev Cytol. 261, 159-192 (2007).
- Campinho, P., et al. Tension-oriented cell divisions limit anisotropic tissue tension in epithelial spreading during zebrafish epiboly. Nat Cell Biol. 15, 1405-1414 (2013).
- Fischer-Friedrich, E., et al. Quantification of surface tension and internal pressure generated by single mitotic cells. Sci Rep. 4, 6213 (2014).
- Moeendarbary, E., Harris, A. R. Cell mechanics: principles, practices, and prospects. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 6, 371-388 (2014).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Alcaraz, J., et al. Microrheology of human lung epithelial cells measured by atomic force microscopy. Biophys J. 84, 2071-2079 (2003).
- Jorba, I., et al. Probing Micromechanical Properties of the Extracellular Matrix of Soft Tissues by Atomic Force Microscopy. J Cell Physiol. 232, 19-26 (2017).
- Hutter, J. L., Bechhoefer, J. Calibration of atomic-force microscope tips. Review of Scientific Instruments. 64, 1868-1873 (1993).
- Lomakina, E. B., et al. Rheological analysis and measurement of neutrophil indentation. Biophys J. 87, 4246-4258 (2004).
- Alcaraz, J., et al. Correction of Microrheological Measurements of Soft Samples with Atomic Force Microscopy for the Hydrodynamic Drag on the Cantilever. Langmuir. 18, 716-721 (2002).
- Daniels, B. R., Masi, B. C., Wirtz, D. Probing single-cell micromechanics in vivo: the microrheology of C. elegans developing embryos. Biophys J. 90, 4712-4719 (2006).
- Kalwarczyk, T., et al. Comparative analysis of viscosity of complex liquids and cytoplasm of mammalian cells at the nanoscale. Nano Lett. 11, 2157-2163 (2011).
- Soroldoni, D., et al. Genetic oscillations. A Doppler effect in embryonic pattern formation. Science. 345, 222-225 (2014).
- He, B., et al. Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation. Nature. 508, 392-396 (2014).
- Johansen, P. L., et al. Optical micromanipulation of nanoparticles and cells inside living zebrafish. Nat Commun. 7, 10974 (2016).
