Ein Flow Cytometry-basierte Zytotoxizität Assay für die Beurteilung der menschlichen NK-Zell-Aktivität
Summary
Eine Flow Cytometry basierende Methode quantitativ bestimmen die zytotoxische Aktivität des menschlichen natürliche Killerzellen wird hier angezeigt.
Abstract
Innerhalb des angeborenen Immunsystems spielen Effektor-Lymphozyten, die sogenannten natürlichen killer (NK)-Zellen eine wesentliche Rolle in der Wirt Verteidigung gegen anomale Zellen, insbesondere Beseitigung Tumor und viral infizierte Zellen. Ca. 30 bekannten monogenen Defekte, zusammen mit einer Vielzahl von anderen pathologischen Zuständen verursachen entweder funktionelle oder klassische NK Zelle Mangel, manifestiert sich in reduziert oder fehlend zytotoxische Aktivität. In der Vergangenheit wurde Zytotoxizität mit radioaktiven Methoden untersucht die mühsam, teuer und potenziell gefährlich sind. Dieser Artikel beschreibt eine optimierte, klinisch einsetzbaren Flow Cytometry basierende Methode um zytotoxische NK-Zell-Aktivität zu quantifizieren. In diesem Test sind peripheren mononukleären Zellen (PBMCs) oder gereinigte NK Zelle Vorbereitungen Co inkubierten bei unterschiedlichen Verhältnissen eine Ziel-Tumor-Zell-Linie bekannt, empfindlich gegen NK zellvermittelte Zytotoxizität (NKCC) sein. Die Zielzellen sind bereits beschriftet mit einem Fluoreszenzfarbstoff ermöglicht ihre Diskriminierung aus den Effektorzellen (NK-Zellen). Nach der Inkubationszeit sind getöteten Zielzellen durch eine Nukleinsäure-Fleck, identifiziert, die speziell die abgestorbenen Zellen durchdringt. Diese Methode ist geeignet, um sowohl Diagnose- und Anwendungen in der Forschung und, Dank an die Multiparameter-Fähigkeiten der Durchflusszytometrie, hat den zusätzlichen Vorteil der potenziell ermöglicht eine tiefere Analyse der NK Zelle Phänotyp und Funktion.
Introduction
Natürliche killer (NK)-Zellen sind eine anspruchsvolle Teilmenge der menschlichen angeborenen Lymphozyten kritisch beteiligt bei der Beseitigung von viral infizierte Zellen, transformierten Zellen und anderen pathogenen Bedrohungen 1,2. NK-Zellen lytische Granulat Haus zytotoxische Proteine, wie Perforin und Granzyme. Nach der Aktivierung NK-Zellen bilden ein komplexes Zusammenspiel mit ihren Zielen bekannt als immunologische Synapse, wobei diese Zytolyse Moleküle lokal freigesetzt werden, was direkte Ziel Zelle Lysis und Apoptose, zusammen mit Freisetzung von Zytokinen und Chemokin und letztlich in der Induktion von einem entzündlichen Zustand 1,3,4.
NK-Zell-Aktivierung beinhaltet eine komplexe Reihe von Aktivierung und hemmende Interaktionen zwischen NK Zell-Rezeptoren und Liganden auf der Oberfläche der Zielzellen, bilden ein streng regulierte System ausgedrückt. Einer der am besten untersuchten Mechanismen der NK-Zell-Aktivierung ist das “fehlende selbst”. In der Tat, fehlende Erkennung der Klasse, die ich major Histocompatibility complex (MHC) oder human Leukocyte Antigen (HLA) Moleküle auf infiziert oder Zellen Trigger NK Zelle Zytotoxizität umgewandelt. Tumor und Virus-infizierten Zellen in der Regel Downregulate diese Antigene T zellvermittelte Immunität, so zum primären NK entkommen Zelle Ziele 1,3,4.
Bewertung der NK-Zell-Funktion ist in erster Linie in Degranulation oder Zytotoxizität kategorisiert Assays. Degranulation Assays, wie die Strömung durchflusszytometrischen Erkennung des Degranulation-assoziierten Markers CD107a, sind jedoch nur Richtwerte der NK-Zell-Aktivierung und nicht ihre ultimative Funktion, die direkte Tötung von Ziel Zellen 5,6,7,8. Daher hat diese Einschränkung Ermittler Zytotoxizität Assays als mehr erzählen und direktere Alternative geschenkt.
Die langjährigen “Goldstandard” für die Beurteilung der zellvermittelten zytotoxische Aktivität von T- und NK-Zellen ist die Chrom-Release-Assay (CRA). CRA beinhaltet radioaktiv Kennzeichnung von Zielzellen mit 51Cr und Bebrüten sie gemeinsam mit Effektorzellen. Dieser Assay ist durchdrungen von dem Grundsatz, dass diese Zelle lyse in der Version des proteingebundenen 51Cr in der Überstand ergibt sich die durch Gamma zählen gemessen werden kann. Dieser Assay, während wirksam, ist für eine Vielzahl von Gründen problematisch: hohe Materialkosten, Handhabung und Entsorgung von radioaktiven 51Cr, spontane Freisetzung von 51Cr und schwierigen Standardisierung – so dass es insgesamt unpraktisch 9,10.
Eine Reihe von nicht-radioaktiven Assays mit fluoreszierenden Kennzeichnung, Enzymfreisetzung und sogar Biolumineszenz, wurden seitdem als Alternativen zum CRA 11,12,13,14entwickelt. Wir beschreiben hier eine Flow Cytometry basierende Methode zur Messung der NK Zelle zytotoxische Aktivität auf K562 Zielzellen, einfache, sensitive und reproduzierbar ist. K562-Zellen sind eine menschliche Erythroleukemic Zelle Linie mit reduzierten Expression von HLA Klasse I und erhöhten Ausdruck von Liganden für activatory NK-Rezeptoren, wodurch sie besonders anfällig für NK zellvermittelte Zytotoxizität 15. In diesem Assay K562 Zellen vorab mit Carboxyfluorescein Diacetat Succinimidyl Ester (CFSE-) gekennzeichnet sind und Co kultiviert in verschiedenen Verhältnissen mit entweder peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) oder NK-Zellen 1gereinigt. CFSE ist eine stabile, Proteinbindung Fluoreszenzfarbstoff, der Diskriminierung von Zielzellen von Effektor NK Zellen 16,17erlaubt. Nach der Co Inkubation dient ein Nukleinsäure-Fleck, speziell durchdringt die Membran von abgestorbenen Zellen, getöteten Zielzellen identifizieren (siehe Tabelle der Materialien). Die Proben werden dann auf einem Durchflusszytometer zu bestimmen, den Anteil der Toten (d. h. Fleck +) erworben CFSE-+ Zielzellen.
Dieser Test kann verwendet werden als diagnostische Reihenuntersuchung für monogene Mängel beeinträchtigen die NK Zellkompartiment, davon gibt es etwa 30 bekannte Mängel verursacht entweder funktionelle oder klassische NK-Zelle-Mangel, und bei primären oder sekundären Hemophagocytic Lymphohistiocytosis. Es ist auch sinnvoll, NK-Zell-Aktivität bei Patienten mit wiederkehrenden, schweren viralen Herpesinfektionen, Immunrekonstitution nach hämatopoetischer Stammzelltransplantation oder Post immunmodulatorische Therapie 18,19,20, bewerten und für eine Vielzahl von Anwendungen in der grundlegenden Forschung zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier beschriebene Methode bietet eine einfache und kostengünstige Alternative zu den traditionellen 51Cr Release Assay zytotoxische NK-Zell-Aktivität zu bewerten. Diese Methode ist empfindlich, reproduzierbare und weniger zeitaufwändig als die bisherigen Standardmethoden wie CRA, und eignet sich für beide klinischen und Forschung Anwendungen.
Während des Tests mit insgesamt PBMCs und angereicherte NK-Zellen arbeitet, ist die Option PBMCs Zellpopulationen zu reinigen ohne di…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten Jill Narciso, UCLA Immungenetik Center, danke für ihre Unterstützung bei der Vorbereitung der Handschrift.
Materials
| Phosphate-buffered Saline (1x, w/o Ca2+ and Mg2+) | Corning (Cellgro) | 21-040-CM | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Tween-20 | Sigma | BP337-100 | |
| RPMI 1640 Media | Corning (Cellgro) | 10-040-CV | |
| Heat-inactivated Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-02 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | Stock solution at 10,000 U/mL |
| IL-2 | R&D Systems | 202-IL-050 | Lyophilized from a 0.2 μm filtered solution in Acetonitrile and TFA with BSA as a carrier protein. Reconstitute with 500 ul at 100 μg/mL in sterile 100 mM Acetic Acid containing at least 0.1% bovine serum albumin (2.1x10E6 IU/ml) |
| K562 Cells | ATCC | CCL-243 | Cancer cell line |
| T-75 cell culture flasks | Corning | 431464 | |
| CFSE cell proliferation kit | Life Technologies (CellTrace) | C34554 | Reconstitute I vial with 18 ul DMSO to prepare a 5mM stock solution. Do not freeze/thaw. |
| Sytox Red | Life Technologies | S34859 | Stock solution is provided at 5 μM in 1 mL DMSO. The DMSO solution may be subjected to multiple freeze-thaw cycles without reagent degradation. |
| Sodium/lithium heparin blood collection tubes | BD | 02-687-95 | |
| U-bottom 96-well plate | Corning | CLS3897 | |
| Serological pipettes | BD Falcon | ||
| Polystyrene round-bottom tubes (5mL) | BD Falcon | 14959-5 | |
| 50 mL polypropylene conical tube | BD Falcon | 352070 | |
| 15 mL polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | |
| Reagent reservoir | USA Scientific | 2321-2230 | |
| Human NK cell enrichment cocktail | StemCell Technologies (RosetteSep) | 15065 |
Referenzen
- Iannello, A., Debbeche, O., Samarani, S., Ahmad, A. Antiviral NK cell responses in HIV infection: I. NK cell receptor genes as determinants of HIV resistance and progression to AIDS. J Leukoc Biol. 84 (1), 1-26 (2008).
- Caligiuri, M. A. Human natural killer cells. Blood. 112 (3), 461-469 (2008).
- Topham, N. J., Hewitt, E. W. Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger?. Immunology. 128 (1), 7-15 (2009).
- Warren, H. S., Smyth, M. J. NK cells and apoptosis. Immunol Cell Biol. 77 (1), 64-75 (1999).
- Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. J Vis Exp. (116), (2016).
- Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry. PLoS One. 10 (10), e0141074 (2015).
- Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J Immunol Methods. 294 (1-2), 15-22 (2004).
- Atkinson, E. A., Gerrard, J. M., Hildes, G. E., Greenberg, A. H. Studies of the mechanism of natural killer (NK) degranulation and cytotoxicity. J Leukoc Biol. 47 (1), 39-48 (1990).
- Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. J Immunol Methods. 325 (1-2), 51-66 (2007).
- Kane, K. L., Ashton, F. A., Schmitz, J. L., Folds, J. D. Determination of natural killer cell function by flow cytometry. Clin Diagn Lab Immunol. 3 (3), 295-300 (1996).
- Jang, Y. Y., et al. An improved flow cytometry-based natural killer cytotoxicity assay involving calcein AM staining of effector cells. Ann Clin Lab Sci. 42 (1), 42-49 (2012).
- Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. J Immunol Methods. 64 (3), 313-320 (1983).
- Karimi, M. A., et al. Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay. PLoS One. 9 (2), e89357 (2014).
- Oppenheim, D. E., et al. Glyco-engineered anti-EGFR mAb elicits ADCC by NK cells from colorectal cancer patients irrespective of chemotherapy. Br J Cancer. 110 (5), 1221-1227 (2014).
- West, W. H., Cannon, G. B., Kay, H. D., Bonnard, G. D., Herberman, R. B. Natural cytotoxic reactivity of human lymphocytes against a myeloid cell line: characterization of effector cells. J Immunol. 118 (1), 355-361 (1977).
- Jedema, I., van der Werff, N. M., Barge, R. M., Willemze, R., Falkenburg, J. H. New CFSE-based assay to determine susceptibility to lysis by cytotoxic T cells of leukemic precursor cells within a heterogeneous target cell population. Blood. 103 (7), 2677-2682 (2004).
- Lecoeur, H., Fevrier, M., Garcia, S., Riviere, Y., Gougeon, M. L. A novel flow cytometric assay for quantitation and multiparametric characterization of cell-mediated cytotoxicity. J Immunol Methods. 253 (1-2), 177-187 (2001).
- Carotta, S. Targeting NK Cells for Anticancer Immunotherapy: Clinical and Preclinical Approaches. Front Immunol. 7, 152 (2016).
- Mandal, A., Viswanathan, C. Natural killer cells: In health and disease. Hematol Oncol Stem Cell Ther. 8 (2), 47-55 (2015).
- Rezvani, K., Rouce, R. H. The Application of Natural Killer Cell Immunotherapy for the Treatment of Cancer. Front Immunol. 6, 578 (2015).
- Angelo, L. S., et al. Practical NK cell phenotyping and variability in healthy adults. Immunol Res. 62 (3), 341-356 (2015).
- Zons, P., et al. Comparison of europium and chromium release assays: cytotoxicity in healthy individuals and patients with cervical carcinoma. Clin Diagn Lab Immunol. 4 (2), 202-207 (1997).
- Yovel, G., Shakhar, K., Ben-Eliyahu, S. The effects of sex, menstrual cycle, and oral contraceptives on the number and activity of natural killer cells. Gynecol Oncol. 81 (2), 254-262 (2001).
- Laue, T., et al. Altered NK cell function in obese healthy humans. BMC Obes. 2, 1 (2015).
- Hazeldine, J., Lord, J. M. The impact of ageing on natural killer cell function and potential consequences for health in older adults. Ageing Res Rev. 12 (4), 1069-1078 (2013).
