Dette arbeidet presenterer en roman behandlings- og bildebehandling protokoll for tykk, tredimensjonal vev tverrsnitt analyse som muliggjør full utnyttelse av konfokale bildeformaliteter. Denne protokollen bevarer antigenicitet og representerer et robust system for å analysere hudhistologi og potensielt andre vevstyper.
Behandling av et vev av interesse for å generere et mikroskopisk bilde som støtter et vitenskapelig argument kan være utfordrende. Oppkjøpet av mikroskopiske bilder av høy kvalitet er ikke helt avhengig av mikroskopets kvalitet, men også på fremgangsmåten for vevsbehandling, som ofte involverer flere kritiske handlinger eller trinn. Videre representerer mesenkymcelletyper i huden og andre vev en ny utfordring for vevsforberedelse og avbildning. Her presenterer vi en komplett prosess, fra vevshøst til mikroskopi. Vår teknikk, kalt "horisontal hele fjellet", er en som nybegynnere kan raskt bli dyktige i og som muliggjør antigenbeskyttelse og deteksjon i 60-300 μm tykke seksjoner kuttet med en kryostat. Seksjoner av denne tykkelsen gir forbedret visualisering av vevsmikarkitektur i et tredimensjonalt miljø. I tillegg bevarer protokollen mesenkymceller på en måte som forbedrer bildekvaliteten nårSammenlignet med standardkryostat eller paraffinseksjoner, og øker dermed effekten og påliteligheten av immunostaining. Vi tror at denne protokollen vil være til nytte for alle laboratorier som visualiserer hud, og muligens andre vev og organer.
Revolusjonen av mikroskopisk avbildningsutstyr sørger for sofistikerte bildeoppløsningsinstrumenter med høy oppløsning. Imidlertid, når du får et mikroskopisk bilde av et komplett tredimensjonalt (3D) vevtverrsnitt, gir preparatet store utfordringer og kan være begrensende faktor for å definere bildekvalitet. Hvert separat trinn fortjener nøye behandling for å bevare vevsmorfologi og antigenitet av målproteiner, for å minimere prosessinducerte gjenstander og for å maksimere den endelige bildekvaliteten. For eksempel krever den tradisjonelle analysen av hud et bilde med utsikt over epidermis og dermis, med hårsekkene som er riktig orientert, slik at den anatomiske analysen av stamcellekammerbidragene til hudhemostase 1 , 2 kan utføres. Dette krever grundig konsentrasjon om hvordan huden er innebygd og snittet. Viktigst, hårsekkene kan være tykkereEnn 100 μm, som i stor grad overgår standardparafin eller frossen seksjonstykkelse, noe som resulterer i en lavere analysemåte sammenlignet med hele fester eller tykke tverrsnitt 3 , 4 , 5 .
Samlet sett er hvert trinn av prøveutarbeidelse for mikroskopisk analyse en kritisk determinant som vil påvirke bildeanalyse. Her presenteres en ny behandlingsprotokoll for tykt, 3D-vev-tverrsnittsanalyse, som vi kaller "horisontalt hele fjellet". Protokollen opprettholder svært antigenicitet og muliggjør full utnyttelse av tykke hudpartier ved å bruke standard konfokal bildeutstyr. Dette er en komplett guide til bruk av hud for tykt vevtverrsnittbehandling og avbildning, inkludert vevshøst og paraformaldehyd (PFA) -assistert kryopreservering (trinn 1), generering av 100 μm tykk vevtverrsnitt med en kryostat (trinn 2) Og immunfluorescerende merking og montering (trinn 3 og 4). De representative resultatene sammenligner konfokale bilder av to forskjellige histologiske forberedelsesteknikker, klassisk krysoseksjonering og tykt 3D-vevs-tverrsnitt, og fremhever fordelene med "horisontale hele fester" for den potensielle brukeren av denne protokollen.
Here, we present the “horizontal whole mount” technique, which has several advantages over classical frozen sections. One advantage of our technique is that it can easily be performed with standard histology equipment and a confocal microscope. Second, the tissue integrity is preserved in a superior manner when compared to standard cryosections. For example, adipocytes within the hypodermal layer (i.e., dermal white adipocytes (DWAT))9 are severely disrupted in standard cryosections, which makes studying tissues that are adipose-laden impossible. Our technique allows for the full analysis of the adipocytes in this layer and may be adapted to other tissues with high adipocyte contents. Furthermore, this allows for the improved detection of mesenchymal cells in lineage-tracing studies 2,10.
Standard cryosections, by their very nature, can never reveal the true 3D aspects of a tissue through confocal microscopy. This means that thicker sections are advantageous in the analysis of skin, since hair follicles, as well as their substructures, can traverse a depth that exceeds the standard thickness of 10 µm used in classical crysosections. We are intrigued that other tissues, such as the intestine and brain, for example, possess similar challenges with regard to viewing the tissue as a 3D structure2,7,11,12,13. Intriguingly, our technique has already been shown to be beneficial for use in certain applications in the intestines14. We believe that our horizontal whole-mount protocol has the potential be applied to any other tissue requiring 3D analysis.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkjenner sponsorering fra Thermo-Fisher Scientific og takker Nikon Imaging Center på Kings College London for støtte under konfokalt bildeoppkjøp.
PBS | homemade | ||
Gelatin, from cold water fish skin | Sigma | G7765 | 250ML |
Glycerol | BDH Laboratory Supplies | 444482V | |
O.C.T. compound | VWR chemicals | 361603E | |
Peel-A-Way embedding molds | Sigma | E6032-1CS | Square S-22 |
Non-Fat Powdered Milk | Bio Basic Inc. | NB0669 | |
Triton X-100 | Sigma | T9284 | 500ML |
4′,6-Diamidino-2-phenylindole, dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | |
FITC Rat Anti-Human CD49f | BD Pharmingen | 555735 | |
Mouse/Rat Integrin alpha 8 Antibody | R&D Systems | AF4076 | |
Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG | Life Technologies | A21208 | |
Alexa Fluor 555 donkey anti-goat IgG | Life Technologies | A21432 | |
CryoStar NX70 | Thermo Fisher Scientific | ||
100mm Culture dishes | |||
Disposable scalpels | Swann-Morton | Ref 0501 | |
pointed metal forceps | |||
1.5 ml microcentrifuge tubes | VWR | 211-2130 | |
12 Well plates | Sigma | CLS3513 | |
Dissecting microscope | Nikon | ||
20 ul and 1000 ul Pipette | Gilson | ||
1000µl XL Graduated TipOne Filter Tip (Sterile) | Star Lab | S1122-1830 | |
20µl Bevelled TipOne Filter Tip (Sterile) | Star Lab | S1120-1810 | |
Rocking shaker plate | |||
Microscope slides, menzel Glaeser | Thermos Scientific | 631-9483 | Superfrost Plus |
Cover Glasses, Menzel Glaeser | Thermos Scientific | MENZBB024060AB | 24 x 60 mm |
Confocal microscope | Nikon |