이 작품은 공 촛점 이미징 양식의 완전한 착취를 가능하게 두께, 3 차원 조직 단면 분석을위한 새로운 처리 및 이미징 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 항원 성을 보존하고 피부 조직 및 잠재적으로 다른 조직 유형을 분석하는 강력한 시스템을 나타냅니다.
과학적 논증을 뒷받침하는 현미경 이미지를 생성하기 위해 관심 조직을 처리하는 것은 어려울 수 있습니다. 고품질 현미경 이미지의 획득은 현미경의 품질뿐만 아니라 종종 여러 가지 중요한 동작이나 단계를 포함하는 조직 처리 방법에도 달려 있습니다. 또한, 피부 및 다른 조직에서의 중간 엽 세포 유형은 조직 준비 및 영상화를위한 새로운 도전 과제이다. 여기, 우리는 조직 수확에서 현미경으로 완전한 과정을 제시한다. "수평 전체 마운트 (horizontal whole mount)"라고 불리는 우리의 기술은 초보자들이 신속하게 능숙해질 수 있고 저온 유지 장치로 절단 된 60-300 μm 두께의 섹션에서 항원 보존과 검출을 가능하게합니다. 이 두께의 섹션은 3 차원 환경에서 조직 마이크로 아키텍처의 향상된 시각화를 제공합니다. 또한, 프로토콜은 중간 엽 세포를 보존 할 때 이미지 품질을 향상시키는 방식으로표준 저온 유지 장치 또는 파라핀 절편과 비교하여 면역 염색의 효능 및 안정성을 증가시킵니다. 우리는이 프로토콜이 피부 및 다른 조직 및 기관을 시각화하는 모든 실험실에 도움이 될 것으로 믿습니다.
현미경 영상 장비의 혁명은 정교하고 고해상도 영상 장비를 제공합니다. 그러나, 완전한 3 차원 (3D) 조직 단면의 현미경 이미지를 획득 할 때, 표본 준비는 상당한 도전을 제시하며 이미지 품질을 정의하는 데있어 제한 요소가 될 수 있습니다. 각각의 개별 단계는 표적 단백질의 조직 형태 및 항원 성을 보존하고, 가공에 의해 유발 된 인공물을 최소화하고, 최종 이미지 품질을 최대화하기 위해 신중한 고려가 필요하다. 예를 들어, 전통적인 피부 분석에서는 표정과 진피를 볼 수있는 이미지가 필요합니다. 모공은 적절하게 배향되어 있으며, 줄기 세포 구획을 피부 항상성 1 , 2에 해부학 적으로 분석 할 수 있습니다. 이것은 피부가 어떻게 매립되고 절단되는지에 대한 철저한 집중이 필요합니다. 중요하게, 모낭은 더 두꺼울 수 있습니다100 μm 이상으로 표준 파라핀이나 동결 절편 두께를 크게 능가하므로 전체 장착 또는 두꺼운 단면 3 , 4 , 5에 비해 분석 표준이 낮아집니다.
종합하여, 현미경 분석을위한 표본 준비의 각 단계는 이미지 분석에 영향을주는 중요한 결정 요소입니다. 여기서 "수평 전체 마운트 (horizontal whole mount)"라고 부르는 두껍고 3D 인 조직 단면 분석을위한 새로운 처리 프로토콜이 제시됩니다. 이 프로토콜은 항원 성을 유지하고 표준 공 촛점 이미징 장비를 사용하여 피부의 두꺼운 부분을 최대한 활용할 수 있습니다. 조직 수확 및 파라 포름 알데히드 (PFA)를 기반으로 한 저온 보존 (단계 1), 저온 저장 장치로 100 μm 두께의 조직 단면 생성 (단계 1)을 포함한 두꺼운 조직 단면 처리 및 이미징을위한 스킨 사용에 대한 완벽한 안내서입니다. 2), 면역 형광성 라벨링 및 마운팅 (단계 3 및 4). 대표적인 결과는이 프로토콜의 잠재적 인 사용자를위한 "수평 전체 마운트"의 장점을 강조하는 두 가지 별개의 조직 학적 준비 기술 (고전적 절제 및 두꺼운 3D 조직 교차 절삭)의 공 촛점 이미지를 비교합니다.
Here, we present the “horizontal whole mount” technique, which has several advantages over classical frozen sections. One advantage of our technique is that it can easily be performed with standard histology equipment and a confocal microscope. Second, the tissue integrity is preserved in a superior manner when compared to standard cryosections. For example, adipocytes within the hypodermal layer (i.e., dermal white adipocytes (DWAT))9 are severely disrupted in standard cryosections, which makes studying tissues that are adipose-laden impossible. Our technique allows for the full analysis of the adipocytes in this layer and may be adapted to other tissues with high adipocyte contents. Furthermore, this allows for the improved detection of mesenchymal cells in lineage-tracing studies 2,10.
Standard cryosections, by their very nature, can never reveal the true 3D aspects of a tissue through confocal microscopy. This means that thicker sections are advantageous in the analysis of skin, since hair follicles, as well as their substructures, can traverse a depth that exceeds the standard thickness of 10 µm used in classical crysosections. We are intrigued that other tissues, such as the intestine and brain, for example, possess similar challenges with regard to viewing the tissue as a 3D structure2,7,11,12,13. Intriguingly, our technique has already been shown to be beneficial for use in certain applications in the intestines14. We believe that our horizontal whole-mount protocol has the potential be applied to any other tissue requiring 3D analysis.
The authors have nothing to disclose.
저자는 Thermo-Fisher Scientific의 후원을 인정하고 공 촛점 이미지 수집 중 지원을 위해 Kings College London의 Nikon Imaging Center에 감사드립니다.
PBS | homemade | ||
Gelatin, from cold water fish skin | Sigma | G7765 | 250ML |
Glycerol | BDH Laboratory Supplies | 444482V | |
O.C.T. compound | VWR chemicals | 361603E | |
Peel-A-Way embedding molds | Sigma | E6032-1CS | Square S-22 |
Non-Fat Powdered Milk | Bio Basic Inc. | NB0669 | |
Triton X-100 | Sigma | T9284 | 500ML |
4′,6-Diamidino-2-phenylindole, dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | |
FITC Rat Anti-Human CD49f | BD Pharmingen | 555735 | |
Mouse/Rat Integrin alpha 8 Antibody | R&D Systems | AF4076 | |
Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG | Life Technologies | A21208 | |
Alexa Fluor 555 donkey anti-goat IgG | Life Technologies | A21432 | |
CryoStar NX70 | Thermo Fisher Scientific | ||
100mm Culture dishes | |||
Disposable scalpels | Swann-Morton | Ref 0501 | |
pointed metal forceps | |||
1.5 ml microcentrifuge tubes | VWR | 211-2130 | |
12 Well plates | Sigma | CLS3513 | |
Dissecting microscope | Nikon | ||
20 ul and 1000 ul Pipette | Gilson | ||
1000µl XL Graduated TipOne Filter Tip (Sterile) | Star Lab | S1122-1830 | |
20µl Bevelled TipOne Filter Tip (Sterile) | Star Lab | S1120-1810 | |
Rocking shaker plate | |||
Microscope slides, menzel Glaeser | Thermos Scientific | 631-9483 | Superfrost Plus |
Cover Glasses, Menzel Glaeser | Thermos Scientific | MENZBB024060AB | 24 x 60 mm |
Confocal microscope | Nikon |