Summary

פרופילינג נגד Neu5Gc IgG ב Sera האדם עם Assay Microarray Sialoglycan

Published: July 13, 2017
doi:

Summary

Assay microarray sialoglycan ניתן להשתמש כדי להעריך נוגדנים נוגדי Neu5Gc ב sera האדם, מה שהופך אותו assay אבחון תפוקה גבוהה פוטנציאל לסרטן ומחלות כרוניות אחרות מתווך דלקת כרונית.

Abstract

תאים מכוסים בגלימה של שרשרות פחמימות (גלייקנים) שמשתנות בדרך כלל בסרטן וכוללות וריאציות של ביטוי חומצי סיאלי (Sia). אלה הם סוכרים חומצי כי יש 9-פחמן עמוד השדרה וכי מכסה חוליות glycans על משטחי התא. שני של צורות סיה הגדולות היונקים הם N- Acetylneuraminic חומצה (Neu5Ac) ואת טופס hydroxylated שלה, N- glycolylneuraminic חומצה (Neu5Gc). בני אדם לא יכולים לייצר אנדוגניים Neu5Gc עקב השבתה של הגן קידוד cytidine 5'monophosphate-Neu5Ac (CMP-Neu5Ac) hydroxylase (CMAH). זר Neu5Gc נרכש על ידי תאים אנושיים באמצעות הצריכה התזונתיים של בשר אדום ומוצרי חלב ולאחר מכן מופיע על glycans מגוונים על פני התא, צובר בעיקר על קרצינומה. כתוצאה מכך, בני אדם מפזרים נוגדנים נגד Neu5Gc שמשחקים תפקידים מגוונים בסרטן ומחלות דלקתיות כרוניות אחרות, אשר הופכים לתהליכים אבחנתיים וטיפוליים פוטנציאלייםתקציבים. כאן, אנו מתארים תפוקה גבוהה sialoglycan assay microarray להעריך נוגדנים אלה נגד Neu5Gc בסרה האדם. Neu5Gc המכילים glycans ואת זוגות מתאימים שלהם של פקדים (Neu5Ac המכילים glycans), כל אחד עם אמין העיקרי הליבה, הם מקושרים קוולנטית כדי אפוקסי מצופה זכוכית שקופיות. אנו מדגימים את הדפסת 56 שקופיות בפורמט 16-היטב באמצעות מדפסת nano ספציפית מסוגל לייצר עד 896 מערכים לכל הדפסה. כל שקופית ניתן להשתמש כדי המסך 16 שונים דגימות sera האדם להערכת אנטי Neu5Gc נוגדנים, ספציפיות וגיוון. הפרוטוקול מתאר את המורכבות של כלי זה חזק ומספק הנחיה בסיסית עבור אלה שמטרתם לחקור את התגובה Neu5Gc פחמימות תזונתיים אנטיגן בדגימות קליניות מגוונות בפורמט מערך.

Introduction

סיאס הם סוכרים חומציים המכסים שרשראות גליקניות על גליקופרוטאינים של תאי תאים וגליקוליפידים בחוליות. ביטוי Sia הוא שונה בתאי סרטן 1 וקושרת עם התקדמות ו / או גרורות 2 , 3 . שני של צורות סיה הגדולות היונקים הם Neu5Ac ואת טופס hydroxylated שלה, Neu5Gc 2 . בני אדם לא יכולים לסנתז Neu5Gc עקב אי פעילות מסוימת של הגן קידוד האנזים CMAH. זה סיא הלא אנושי מטבולית משלבת לתוך תאים אנושיים כמו "עצמי", שמקורה מזון תזונתיים Neu5Gc עשירים ( למשל, בשר אדום) 4 , 5 . Neu5Gc נמצא ברמות נמוכות על משטחי התא של אפיתל אנושי ואנדוטליה, אך הוא נצבר במיוחד בקרצינומה. Neu5Gc מזוהה זרים על ידי מערכת החיסון האנושית הומור 2 , 6 .המורכבות האנטיגנית של Neu5Gc-glycans עשויה להתעורר ברמות רבות, כולל שינוי Neu5Gc, הצמדה, גליקנים בסיסיים ו פיגומים, ואת הצפיפות שלהם, כל לידי ביטוי על ידי המורכבות של נוגדנים נוגדן Neu5Gc בבני אדם 6 . חלק מנוגדנים אלה משמשים ביומרקרים קרצינומה פוטנציאל immunotherapeutics 7 . הופעתו של chemoenzymatic סינתזה של sialoglycans שונים 8 סללה את הדרך לניתוח מעמיק יותר של נוגדנים כאלה, בהנחיית השימוש בטכנולוגיה microiray glycan 9 , 10 . לכן, עם ההכנה להקל על מניפולציה של ספריות גדולות של פחמימות טבעיות וסינתטיות, microlyrays glycan הפכו טכנולוגיה תפוקה גבוהה עוצמה לחקר האינטראקציות של פחמימות עם מספר עצום של biomolecules 10 , 11 , </sup> 12 , 13 . בתבנית מערך, כמות מינימלית של חומרים משמשים, ואת זה להציג multivalent של glycans רלוונטי מבחינה ביולוגית מאפשר חקירה של אלפי אינטראקציות מחייבות בניסוי אחד. חשוב לציין, טכנולוגיה זו יכולה להיות מיושמת גם גילוי ביולוגי ו לניטור תגובות החיסון בדגימות שונות 7 , 12 .

מוצלח glycan ייצור microarray מחייב את השיקול של שלושה היבטים חשובים: סוג הרובוט מדפסת, כימיה glycan הצמידה, אופטיקה זיהוי. לגבי שיקול כלי ההדפסה, שתי טכניקות זמינות: מדפסות מגע ומגע. בדפוס מגע, 1-48 סיכות פלדה הם טבל לתוך צלחת מקור רב גם המכיל פתרון glycan והם הבחינו על שקופיות זכוכית פונקציונלי ידי מגע ישיר משטח שקופיות זכוכית. כמות הפתרון דה הכבד לשקופית הוא פונקציה של משך זמן מתמשכת על משטח השקופית. בדרך כלל, הדגימות הם הראשונים מראש מנומר על בלוק זכוכית (כדי להגיע כתמים הומוגנית) לפני שהם מודפסים על משטח השקופית. במדפסות ללא מגע ( לדוגמה, מדפסת piezo אלקטרוני), גליקים מודפסים מן נימי זכוכית באמצעות אותות חשמליים מבוקרת. האות החשמלי יכול להיות מכויל היטב כדי להשיג הדפסה מדויקת יותר ביחס להדפסה של איש קשר. גודל ומורפולוגיה של כתמים הם גם יחסית הומוגנית יותר. יתרון נוסף הוא מיחזור המדגם חזרה לצלחת המקור לאחר ההדפסה. עם זאת, החיסרון העיקרי של מדפסות piezo-Electronic הוא הגבלת קצה ההדפסה (4 או 8), וכתוצאה מכך משך הדפסה ארוך מאוד, המחייב תשומת לב מיוחדת ליציבות שקופיות, טמפרטורה, לחות והתאדות מדגם. מדפסת הזרקת הדיו שאינה מזדקקת דורשת כמות גדולה יותר של מדפסות 14 .

<p class = "jove_content"> בניגוד לאפשרויות הזמינות המוגבלות לשיטות הדפסה, כימיה גליקן הצמידה היא שיקול מורכב יותר, עם אפשרויות רבות לבחירה. כימיה immobilization נבחר חייב בחשבון הן את הקבוצות הפעילות על glycans ואת תגובת משטח שקופיות. את glycans להיות משותקת על משטח מסוים microarray, או synthtically synthesized או מבודד באופן טבעי, כל דורשים קבוצה תגובתי זהה. בנוסף, glycans צריך להיות טהור הומוגנית. מצד שני, משטח immobilization ואת הכימיה צריכה לספק reproducibility וצפיפות מצורף אמין. שיטות רבות immobilization פותחו עם קוולנטיים או לא קוולנטי (קליטה פיזית) 10 , 11 , 12 , 13 . לקבלת מידע מפורט על מודפס טכנולוגיית microarray glycan עבור uninitiateD, עיין אלה ביקורות מצוינות 13 , 15 . חשוב לציין, המידע המינימלי האחרון הנדרש עבור ניסוי Glycomics (MIRAGE) יוזמה מתאר הנחיות להכנת המדגם 16 ולדיווח נתונים מניתוח microarray glycan 17 כדי לשפר את הסטנדרטים בתחום זה גדל.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור ייצור של microarrays sialoglycan באמצעות קשר ספציפי nano מדפסת בפורמט 16-היטב. כל אחד glycans יש אמין הראשי כי לתווך קוולנטי שלהם קישור אפוקסי-מופעל שקופיות זכוכית. כמו כן, אנו מתארים את הפיתוח והניתוח של שקף אחד באמצעות דגימות שונות של סרה אנושית, נוגדנים, וסטטינים של צמחים מחברים. מבחני microarray Sialoglycan לערב כמה צעדים עיקריים הכוללים ייצור מערך, עיבוד, פיתוח וניתוח. מערך מערך דורש תכנון arRay פריסה, הכנת glycans ואת צלחת המקור, תכנות nano מדפסת, והדפסת שקופיות. לאחר מכן, השקפים מעובדים, מפותחים, ונותחו ( איור 1 ).

Protocol

דגימות סרה אנושיות התקבלו מבנק הדם הישראלי והשתמשו בהן בהתאם להצהרת הלסינקי ולמועצת הסקירה המוסדית של אוניברסיטת תל אביב. 1. מערך ייצור תכנון פריסה קבע את פריסת השקופית. הערה: …

Representative Results

מערך הדפסה, פיתוח וניתוח: הדפסת microarray sialoglycan עם דגימות glycan מרובים האדם IgG STD עקומות ב 16 בלוקים שונים דורש כיול יסודי על מנת להבטיח כי כל הדגימות מודפסים כמו אחיד ככל האפשר בכל 16 בלוקים לכל שקופית לכ…

Discussion

מוצלח glycan ייצור microarray דורש תכנון זהיר כולל מספר שלבים חשובים בפרוטוקול. אלה כוללים: (1) תכנון פריסות הבלוק והצלחות המגדירים את כל הפרמטרים הבאים ( לדוגמה, מרחקים, ריווח, כמות הדגימות והדפסה); (2) לנקות את הסיכות ולהבטיח שלמות הדק, שהיא קריטית לשליטה בהומוגניות ספוטי?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה בחלקם על ידי קרן מחקר מחקר ופיתוח של הקרן למחקר הסרטן בישראל, מענק מהקרן הלאומית לננוטכנולוגיה וקרן הצדקה של הלמסלי עבור תחום מוקד על ננו-רפואה לתרנוסטים מותאמים אישית (VP-K) מכוני בריאות מענק R01GM076360 (ל- XC).

Materials

Primary-amine containing sialoglycans Glycohub, Inc., Davis, CA, USA (http://www.glycohub.com/services) Contact info@glycohubusa.com for compound requests Printed glycans
Monosodium phosphate monohydrate Sigma S9638 Printing buffer component
Disodium phosphate heptahydrate Sigma S9390 Printing buffer component
Phosphate buffered saline Hy-Labs BP-507/500D Printing buffer/ incubation/washing buffer
Tris-base Sigma T1503 Slide blocking reagent
Glycerol Sigma G-7893 Printing buffer component
Ethanolamine Thermo-Fisher Scientific 0700/08 Slide blocking reagent
Ovalbumin (Grade V) Sigma A5503 Slide Blocking protein
Tween-20 Sigma P7949 Slide washing detergent
Alexa 555-Hydrazide Thermo-Fisher Scientific A20501MP Marker on array
ChromPure Human IgG, whole molecule Jackson Immunoresearch 009-000-003 Printing component
Biotinylated- SNA Vector Laboratories B-1305 Plant Lectin – binding Sia-alpha2–6-linked
Biotinylated-MALII Vector Laboratories B-1265 Plant Lectin – binding Sia-alpha2–3-linked
Chicken-anti Neu5Gc IgY BioLegend 146903 Primary detection
Cy3-Streptavidin Jackson Immunoresearch 016-160-0848 Biotin binding
Cy3-anti Human IgG Jackson Immunoresearch 109-165-088 Secondary detection against human IgG
Cy3-anti Chicken IgY Jackson Immunoresearch 703-165-155 Secondary detection against chicken IgY
Human sera samples Israeli Blood Bank Primary detection
Compressed Nitrogen (Grade 5) General dusting/drying tool
Epoxy-coated slides Corning 40044 Slides
Epoxy-coated slides PolyAn 2D 104-00-221 Slides. In this type of slides the surface is more hydrophobic (compared to Coring slides) therefore the glycans Print Buffer would need to be supplemented with 0.005% Tween-20 to obtain 100 µm size spots.
384-well microtiter plate Genetix 2070 Printing plate
VWR lab marker VWR 52877-310 Slide labeling
Staining Tube ArrayIt MST Slide developing tool
Staining bath VWR 25608-904 Slide developing tool
Slides glass holders VWR 631-9321 Slide developing tool
GenePix Scanner Molecular devices 4000B Slide scanner
LM-60 NanoPrinter ArrayIt LM-60 Array printer
Pins ArrayIt 946MP3 Printing pins
ProPlate Module Grace Bio-Labs P37004 Slide developing module
Distilled water Bio-Lab 2321020500 Required for arrayer and humidifier
Electronic Multi Pippete, 8 Channel , volume range 2-125 μL Thermo-Fisher Scientific (Matrix) MA-2131 Impact2 Equalizer 384 Multi pippete for sample dispansing into 384-well plate

Referenzen

  1. Padler-Karavani, V. Aiming at the sweet side of cancer: Aberrant glycosylation as possible target for personalized-medicine. Cancer Lett. 352 (1), 102-112 (2014).
  2. Amon, R., Reuven, E. M., Leviatan Ben-Arye, ., Padler-Karavani, S., V, Glycans in immune recognition and response. Carbohydr Res. 389, 115-122 (2014).
  3. Häuselmann, I., Borsig, L. Altered tumor-cell glycosylation promotes metastasis. Front Oncol. 4, (2014).
  4. Tangvoranuntakul, P., et al. Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (21), 12045-12050 (2003).
  5. Bardor, M., Nguyen, D. H., Diaz, S., Varki, A. Mechanism of uptake and incorporation of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid into human cells. J Biol Chem. 280 (6), 4228-4237 (2005).
  6. Padler-Karavani, V., et al. Diversity in specificity, abundance, and composition of anti-Neu5Gc antibodies in normal humans: potential implications for disease. Glycobiology. 18 (10), 818-830 (2008).
  7. Padler-Karavani, V., et al. Human xeno-autoantibodies against a non-human sialic acid serve as novel serum biomarkers and immunotherapeutics in cancer. Cancer Res. 71 (9), 3352-3363 (2011).
  8. Cao, H., Chen, X. General consideration on sialic acid chemistry. Methods Mol Biol. 808, 31-56 (2012).
  9. Deng, L., Chen, X., Varki, A. Exploration of sialic Acid diversity and biology using sialoglycan microarrays. Biopolymers. 99 (10), 650-665 (2013).
  10. Liang, C. H., Hsu, C. H., Wu, C. Y. Sialoside Arrays: New Synthetic Strategies and Applications. Top Curr Chem. 367, 125-149 (2015).
  11. Song, X., Heimburg-Molinaro, J., Smith, D. F., Cummings, R. D. Glycan microarrays of fluorescently-tagged natural glycans. Glycoconj J. 32 (7), 465-473 (2015).
  12. Muthana, S. M., Gildersleeve, J. C. Glycan microarrays: powerful tools for biomarker discovery. Cancer Biomark. 14 (1), 29-41 (2014).
  13. Rillahan, C. D., Paulson, J. C. Glycan microarrays for decoding the glycome. Annu Rev Biochem. 80, 797-823 (2011).
  14. Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F., Cummings, R. D. Preparation and analysis of glycan microarrays. Curr Protoc Protein Sci. 12 (10), (2011).
  15. Park, S., Gildersleeve, J. C., Blixt, O., Shin, I. Carbohydrate microarrays. Chem Soc Rev. 42 (10), 4310-4326 (2013).
  16. Struwe, W. B., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: sample preparation guidelines for reliable reporting of glycomics datasets. Glycobiology. 26 (9), 907-910 (2016).
  17. Liu, Y., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: improving the standards for reporting glycan microarray-based data. Glycobiology. , (2016).
  18. Hara, S., Yamaguchi, M., Takemori, Y., Furuhata, K., Ogura, H., Nakamura, M. Determination of mono-O-acetylated N-acetylneuraminic acids in human and rat sera by fluorometric high-performance liquid chromatography. Anal Biochem. 179 (1), 162-166 (1989).
  19. Padler-Karavani, V., et al. Cross-comparison of protein recognition of sialic acid diversity on two novel sialoglycan microarrays. J Biol Chem. 287 (27), 22593-22608 (2012).
  20. Padler-Karavani, V., Varki, A. Potential impact of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid on transplant rejection risk. Xenotransplantation. 18 (1), 1-5 (2011).
  21. Samraj, A. N., et al. A red meat-derived glycan promotes inflammation and cancer progression. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (2), 542-547 (2015).
  22. Pearce, O. M., Läubli, H. Sialic acids in cancer biology and immunity. Glycobiology. 26 (2), 111-128 (2016).
  23. Alisson-Silva, F., Kawanishi, K., Varki, A. Human risk of diseases associated with red meat intake: Analysis of current theories and proposed role for metabolic incorporation of a non-human sialic acid. Mol Aspects Med. 51, 16-30 (2016).
  24. Pearce, O. M., et al. Inverse hormesis of cancer growth mediated by narrow ranges of tumor-directed antibodies. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (16), 5998-6003 (2014).
  25. Pham, T., et al. Evidence for a novel human-specific xeno-auto-antibody response against vascular endothelium. Blood. 114 (25), 5225-5235 (2009).
  26. Reuven, E. M., et al. Characterization of immunogenic Neu5Gc in bioprosthetic heart valves. Xenotransplantation. 23 (5), 381-392 (2016).
  27. Ghaderi, D., Taylor, R. E., Padler-Karavani, V., Diaz, S., Varki, A. Implications of the presence of N-glycolylneuraminic acid in recombinant therapeutic glycoproteins. Nat Biotechnol. 28 (8), 863-867 (2010).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Leviatan Ben-Arye, S., Yu, H., Chen, X., Padler-Karavani, V. Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera with a Sialoglycan Microarray Assay. J. Vis. Exp. (125), e56094, doi:10.3791/56094 (2017).

View Video