Avaliação da homeostase Dopaminergic em camundongos pelo uso de análise de cromatografia líquida de alta performance e captação da dopamina Synaptosomal
Summary
Absorção de dopamina synaptosomal e ferramentas experimentais de cromatografia líquida de alto desempenho análise representam para investigar a homeostase de dopamina em camundongos avaliando-se a função do transportador de dopamina e níveis de dopamina no tecido striatal, respectivamente. Aqui nós apresentamos protocolos para medir o teor de tecido de dopamina e avaliar a funcionalidade do transportador de dopamina.
Abstract
Dopamina (DA) é um neurotransmissor moduladora, controlando a atividade motora, processos de recompensa e função cognitiva. Comprometimento da neurotransmissão dopaminérgico (DAergic) é fortemente associado com várias doenças associadas a sistema nervoso central, tais como a doença de Parkinson, transtorno déficit-hiperatividade e dependência de drogas1,2 ,3,4. Delinear os mecanismos de doença que envolvem o desequilíbrio DA é criticamente dependente de modelos animais para imitar os aspectos das doenças, e assim protocolos que avaliam a partes específicas do DA homeostase são importantes para fornecer novos insights e possível terapêutico alvos para estas doenças.
Aqui, apresentamos dois protocolos experimentais úteis que quando combinados fornecem uma leitura funcional do sistema de DAergic em camundongos. Parâmetros bioquímicos e funcionais na homeostase DA são obtidos através da avaliação dos níveis DA e de funcionalidade de transporte (DAT) dopamina5. Ao investigar o sistema DA, a capacidade de medir confiantemente níveis endógenos do cérebro de um adulto é essencial. Portanto, apresentamos como realizar a cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) no tecido cerebral de ratos para determinar os níveis de DA. Podemos realizar o experimento no tecido do striatum dorsal (dStr) e núcleo accumbens (NAc), mas o método também é apropriado para outras áreas do cérebro DA-inervada.
DAT é essencial para a recaptação para o terminal pré-sináptica, assim, controlar a atividade temporal e espacial de DA. lançado Saber os níveis e a funcionalidade do DAT no striatum é de grande importância na avaliação DA homeostase. Aqui, nós fornecemos um protocolo que permite deduzir simultaneamente informações sobre níveis de superfície e função usando um ensaio de absorção de synaptosomal6 DA.
Atuais métodos combinados com protocolos padrão immunoblotting fornecem o pesquisador com ferramentas relevantes para caracterizar o sistema de DAergic.
Introduction
Dopamina (DA) é um neurotransmissor moduladora essencial para comportamento motor, recompensa e função cognitiva1,7,8,9. Desequilíbrios na homeostase DA estão implicados nas várias doenças neuropsiquiátricas como transtorno de déficit de atenção e hiperatividade, vício em drogas, depressão e doença de Parkinson1. DA é liberada a partir o neurônio pré-sináptica para a fenda sináptica, onde liga a e ativa receptores na membrana pré e pós-sináptica, transmitindo, assim, mais o sinal. O nível na sinapse após lançamento é espacial e temporalmente controlado por DAT3,10. O transportador sequestra do espaço extracelular e, portanto, sustenta fisiológica DA níveis3,11. Remoção de genética de DAT em camundongos faz com que um fenótipo hiperdopaminérgicas caracterizado por níveis elevados DA sinápticos, depleção de intracelular DA piscinas e mudanças profundas na pós-sináptica DAergic10,12de sinalização.
Aqui, apresentam-se dois protocolos separados, um método de medida DA tecido conteúdo e outro para avaliar a funcionalidade do DAT. combinado com o ensaio de superfície biotinylation descrito por Gabriel et al13 esses dois métodos fornecem informações sobre DA conteúdo e funcionais níveis de DAT para uma avaliação completa DA homeostase. Com estes métodos DA homeostase de vários ratos transgénicos ou modelos de doença pode ser caracterizado e descrito. Estas ferramentas foram implementadas e optimizadas e são de uso padrão em nossos laboratórios. Ensaios atuais têm servido para investigar as consequências sobre a homeostase de alterar o C-terminal da DAT14 ou expressam a recombinase Cre sob a Tirosina Hidroxilase (TH) promotor 5.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este manuscrito descreve protocolos experimentais úteis para delinear DA homeostase em qualquer modelo do rato da escolha. Nós fornecemos protocolos detalhados para medição de níveis no tecido cerebral de ratos usando HPLC e synaptosomal DA absorção para avaliar funcional DA transporte através de DAT. Os procedimentos, protocolos e limites para o experimento HPLC e ensaio de absorção DA synaptosomal serão elaborados abaixo.
O protocolo de captação synaptosomal pode fornecer uma vi…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo UCPH 2016 programa de excelência (U.G., A.R., K.J.), a Fundação Lundbeck (M.R.) a Fundação Lundbeck centro de biomembranas em nanomedicina (U.G.), o nacional Instituto de saúde subsídios P01 DA 12408 (U.G.), o dinamarquês Conselho para a investigação independente – ciências médicas (U.G.).
Materials
| COMT inhibitor | Sigma Aldrich, Germany | RO-41-0960 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| [3H]-Dopamine | Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA | NET67-3001MC | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Glass microfiber filters | GF/C Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire | 1822-024 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| HiSafe Scintillation fluid | Perkin Elmer | 1200-437 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| MicroBeta2 | Perkin Elmer | For synaptosomal DA uptake protocol | |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific Pierce | 23225 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| HEPES | Sigma Life Science | H3375 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Sucrose | Sigma Life Science | S7903 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| NaCl | Sigma Life Science | S3014 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| KCl | Sigma Life Science | P9541 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| CaCl2 | Merck KGaA | 10043-52-4 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| MgSO4 | Sigma Life Science | 63065 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Ascorbic Acid | Sigma Life Science | A0278 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| D-Glucose | Sigma Life Science | G7021 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Pargyline | Sigma Aldrich | P-8013 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Desipramine | Sigma Aldrich | D3900 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Dopamine | Sigma Life Science | H8502 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Cocaine | Sigma Life Science | C5776 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Brain matrix | ASI instruments | RBM2000C | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Cafano mechanical teflon disrupter | Buch & Holm | Discontinued | For synaptosomal DA uptake protocol (homogenization) |
| Antec Decade (Amperometric detector) | Antec, Leiden, The Netherlands | Discontinued: new model DECADE Elite / Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
| Avantec 0.22 μm glass filter | Frisenette ApS, Denmark | 13CP020AS | For HPLC protocol |
| Column: Prodigy 3 μ ODS-3 C18 | Phenomenex, YMC Europe, Chermbeck, Germany | Part Number:00A-3300-E0 | For HPLC protocol |
| LC solution software | Shimadzu | LabSolutions Series Workstation | For HPLC protocol |
| Perchlor acid 0.1M | Fluka Analytical | 35418-500ml | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
| EDTA | Sigma | E5134-50g | For HPLC protocol |
| Natriumdihydrogenphosphar | Bie&Berntsen | 1.06346 1000g | For HPLC protocol |
| Sodium 1-octanesulfonate monohydrate | Aldrich | 74885 -10g | For HPLC protocol |
| Acetonitrile, isocratic HPLC grade | Scharlau | AC03402500 | For HPLC protocol |
| Filtre 0.22um | Frisenette ApS, Denmark | Avantec 13CP020AS | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
| ortho-Phosphoric acid 85% | Merck | 1.00563. 1000ml | For HPLC protocol |
| Electrode | Antec, Leiden, The Netherlands | AN1161300 | For HPLC protocol (see manual online) |
| Detector program on DECADE II electrochemical detector | Antec, Leiden, The Netherlands | Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
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