Bewertung der dopaminergen Homöostase bei Mäusen durch Verwendung von High-Performance Liquid Chromatography Analyse und Synaptosomal Dopamin-Aufnahme
Summary
Synaptosomal Dopamin Aufnahme und Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie dar experimentelle Analysetools, Dopamin Homöostase bei Mäusen durch die Beurteilung der Funktion der Dopamin-Transporter und Dopamin-Spiegel in striatalen Gewebe zu untersuchen, bzw.. Hier präsentieren wir Protokolle zur Messung Dopamin Gewebe Inhalt und die Funktionalität der Dopamin-Transporter zu beurteilen.
Abstract
Dopamin (DA) ist eine modulierende Neurotransmitter, die Steuerung der Motorik, Belohnung Prozesse und kognitive Funktion. Wertminderung (DAergic) dopaminergen Neurotransmission ist stark verbunden mit mehreren zentralen Nervensystems-assoziierten Erkrankungen wie Morbus Parkinson, Aufmerksamkeit-Defizit-Hyperaktivitäts-Störung und Drogensucht1,2 ,3,4. Abgrenzung von Krankheitsmechanismen, bei denen DA Ungleichgewicht hängt entscheidend von Tiermodellen, Aspekte der Krankheiten imitieren und somit Protokolle, die bestimmte Teile der DA Homöostase zu beurteilen sind wichtig, damit die neue Einblicke und mögliche therapeutische Ziele für diese Krankheiten.
Hier präsentieren wir zwei nützliche experimentelle Protokolle, die in Kombination bieten eine funktionale Auslesung des DAergic Systems bei Mäusen. Biochemische und funktionelle Parameter auf DA Homöostase werden durch Bewertung der DA Ebenen und Dopamin-Transporter (DAT) Funktionalität5gewonnen. Bei der Untersuchung von DA-System ist die Fähigkeit, zuverlässig endogenen DA von Erwachsenen Gehirn messen unerlässlich. Deshalb präsentieren wir Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) ausführen auf Gehirngewebe von Mäusen zu ermitteln der DA. Wir führen das Experiment auf Gewebe aus dorsalen Striatum (dStr) und Nucleus Accumbens (NAc), aber die Methode ist auch geeignet für andere DA innerviert Hirnareale.
DAT ist essentiell für Reuptake von DA in die präsynaptischen Terminal, dadurch Steuerung der zeitlichen und räumlichen Aktivität von freigegebenen DA. Zu wissen, die Ebenen und die Funktionalität der DAT im Striatum ist von großer Bedeutung bei der Beurteilung DA Homöostase. Hier bieten wir ein Protokoll, das ermöglicht, gleichzeitig Informationen über Ebenen Oberfläche und Funktion mit einem synaptosomal6 DA Aufnahme Assay abzuleiten.
Aktuelle Methoden in Verbindung mit standard Immunoblotting Protokolle geben die Forscher mit entsprechenden Tools zur Charakterisierung des DAergic-Systems.
Introduction
Dopamin (DA) ist eine modulierende Neurotransmitter für motor Verhalten, Belohnung und kognitive Funktion1,7,8,9von entscheidender Bedeutung. Ungleichgewichte in DA Homöostase sind in mehreren neuropsychiatrischen Erkrankungen wie Aufmerksamkeits-Defizit-Hyperaktivitäts-Störung, Drogensucht, Depressionen und Parkinson-Erkrankung1verwickelt. DA erscheint aus der präsynaptischen Neuron in den synaptischen Spalt, wo er bindet an und aktiviert Rezeptoren auf der Prä- und postsynaptischen Membran, dadurch weiter vermitteln das Signal. Das Niveau der DA in der Synapse nach Veröffentlichung räumlich und zeitlich gesteuert DAT3,10. Der Transporter Sequester DA aus dem extrazellulären Raum und trägt somit physiologische DA Level3,11. Genetischer Entfernung von DAT bei Mäusen verursacht einen Hyperdopaminergic Phänotyp gekennzeichnet durch erhöhte synaptische DA, Abbau der intrazellulären DA Pools und tief greifende Veränderungen im postsynaptischen DAergic Signalisierung10,12.
Hier zwei getrennte Protokolle werden vorgestellt, eine Methode zu messen DA Gewebe Inhalten und anderen zu beurteilen, die Funktionalität der DAT.-kombinierte mit der Oberfläche Biotinylierungen Assay von Gabriel Et Al.13 beschrieben diese beiden Methoden geben Auskunft über DA Inhalte und funktionalen Ebenen der DAT für eine gründliche Bewertung der DA Homöostase. Mit diesen Methoden kann DA Homöostase der verschiedenen transgenen Mäusen oder Krankheitsmodelle charakterisiert und beschrieben werden. Diese Werkzeuge wurden implementiert und optimiert und sind standard in unseren Labors. Aktuelle Tests dienten dazu, die Konsequenzen auf die DA Homöostase der Änderung der C-terminalen DAT14 oder mit dem Ausdruck Cre-Rekombinase unter die Tyrosin-Hydroxylase (TH) Veranstalter 5zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Manuskript beschreibt nützliche experimentelle Protokolle um DA Homöostase in jeder Maus-Modell der Wahl abzugrenzen. Wir bieten ausführliche Protokolle für Messhöhen DA im Gehirngewebe von Mäusen mit HPLC und synaptosomal DA Aufnahme um zu beurteilen, funktionale DA Transport durch DAT. Verfahren, Protokolle und Grenzwerte für die HPLC-Experiment und synaptosomal DA Aufnahme Assay werden unten ausgearbeitet.
Die synaptosomal Aufnahme Protokoll bieten nützliche Einblicke in die …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch die UCPH 2016 Program Of Excellence (UG, A.R, k.j.), die Lundbeck Foundation (m.r.) die Lundbeck-Stiftung Zentrum für Biomembranen in Nanomedizin (UG), die nationale Institute der Gesundheit Stipendien P01 DA 12408 (UG), die dänische Rat für unabhängige Forschung – medizinische Wissenschaften (UG).
Materials
| COMT inhibitor | Sigma Aldrich, Germany | RO-41-0960 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| [3H]-Dopamine | Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA | NET67-3001MC | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Glass microfiber filters | GF/C Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire | 1822-024 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| HiSafe Scintillation fluid | Perkin Elmer | 1200-437 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| MicroBeta2 | Perkin Elmer | For synaptosomal DA uptake protocol | |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific Pierce | 23225 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| HEPES | Sigma Life Science | H3375 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Sucrose | Sigma Life Science | S7903 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| NaCl | Sigma Life Science | S3014 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| KCl | Sigma Life Science | P9541 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| CaCl2 | Merck KGaA | 10043-52-4 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| MgSO4 | Sigma Life Science | 63065 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Ascorbic Acid | Sigma Life Science | A0278 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| D-Glucose | Sigma Life Science | G7021 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Pargyline | Sigma Aldrich | P-8013 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Desipramine | Sigma Aldrich | D3900 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Dopamine | Sigma Life Science | H8502 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Cocaine | Sigma Life Science | C5776 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Brain matrix | ASI instruments | RBM2000C | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Cafano mechanical teflon disrupter | Buch & Holm | Discontinued | For synaptosomal DA uptake protocol (homogenization) |
| Antec Decade (Amperometric detector) | Antec, Leiden, The Netherlands | Discontinued: new model DECADE Elite / Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
| Avantec 0.22 μm glass filter | Frisenette ApS, Denmark | 13CP020AS | For HPLC protocol |
| Column: Prodigy 3 μ ODS-3 C18 | Phenomenex, YMC Europe, Chermbeck, Germany | Part Number:00A-3300-E0 | For HPLC protocol |
| LC solution software | Shimadzu | LabSolutions Series Workstation | For HPLC protocol |
| Perchlor acid 0.1M | Fluka Analytical | 35418-500ml | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
| EDTA | Sigma | E5134-50g | For HPLC protocol |
| Natriumdihydrogenphosphar | Bie&Berntsen | 1.06346 1000g | For HPLC protocol |
| Sodium 1-octanesulfonate monohydrate | Aldrich | 74885 -10g | For HPLC protocol |
| Acetonitrile, isocratic HPLC grade | Scharlau | AC03402500 | For HPLC protocol |
| Filtre 0.22um | Frisenette ApS, Denmark | Avantec 13CP020AS | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
| ortho-Phosphoric acid 85% | Merck | 1.00563. 1000ml | For HPLC protocol |
| Electrode | Antec, Leiden, The Netherlands | AN1161300 | For HPLC protocol (see manual online) |
| Detector program on DECADE II electrochemical detector | Antec, Leiden, The Netherlands | Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
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