b 激酶 1/α (ikkniα-chuk) 是一种 ser/thr 蛋白激酶, 主要通过激活 nf-b 转录因子参与无数的细胞活动。在这里, 我们描述了生产和晶体结构测定这种蛋白质所需的主要步骤。
一类细胞外刺激需要激活 ikkenα, 以诱导 nf-b 亚基 (p52) 通过处理其前体 p52 来产生。p52 的功能是作为一个同相或异质体与另一个 nf-b 亚基, reb。这些二聚体反过来调节与炎症、细胞存活和细胞周期有关的数百种基因的表达。ikktuα主要与 ikk2/β和 nemo 作为三元复合体保持联系。然而, 它的一小部分也被观察为低分子量复合物。不知道 p100 处理活动是否由在较大或较小的复杂池中激活 ikkenα触发。在几种癌症和炎症性疾病中检测到了 ikk% α的组织活性。为了了解 ikknα的激活机制, 并使其作为药物靶标的使用, 我们在不同的宿主系统中表达了重组的 ikknα, 如大肠杆菌、昆虫和哺乳动物细胞。我们成功地在感染杆状病毒的昆虫细胞中表达了可溶性 ikk定α, 获得了毫克数量的高纯度蛋白质, 在抑制剂存在的情况下将其结晶, 并确定其 x 射线晶体结构。在这里, 我们描述了生产重组蛋白的详细步骤, 它的结晶, 以及它的 x 射线晶体结构的测定。
从炎症和免疫到生存和死亡, 不同的细胞功能都需要 nf-b 家族的转录活性。这些活动在细胞中得到严格控制, 失去调节导致各种病理条件, 包括自身免疫性疾病和癌症1、2、3.在没有刺激的情况下, n f-b 的活性被 b (-b) 蛋白4的抑制剂所抑制。在 b 蛋白上特定的尔斯残基的磷酸化标志着它们的泛化和随后的蛋白酶体降解或选择性处理5。两个高度同源的 ser/thr 激酶, ikk2/ββ和 ikkneα, 通过执行这些磷酸化事件6,7作为 nf-b 活动的中央调节器。
配体和受体之间的相互作用通过一系列介质传输信号, 从而激活 nf-b 因子。nf-b 信号过程大致可分为两种不同的途径–规范和非规范 (替代)8。ikk2/β的活性主要调节对炎症和先天免疫反应至关重要的规范途径的nf-b 信号9。这种途径的一个显著特点是 ik2/β10在一个迄今没有生化特征的 ikk 复合体中快速而短暂地激活–假定由 ikk1 和 ikk2 以及一个调节组件–nemo (nf-b 调制器) 组成)11,12,13。在 ikk 复合体的两个催化 ikk 亚基之间, ikk2 主要负责14特定残基的原型 b (α,-β, 和-γ) 的特定残基的磷酸化, 并与 nf-b 结合, 并且非典型的 b 蛋白 nf-b送往 105, 这是一种nf-b p50 亚基5的前体.磷酸化诱导的泛化和蛋白酶体降解的 i b (或 p105 的处理) 导致释放和激活一组特定的 nf-b 二聚体 15.由于 ikk2 功能失调而引起的异常 nf-b 活性已在许多癌症以及 2, 3,16例自身免疫性疾病中观察到。
与 ikk2/βl 相比, ikk这家α的活性调节非规范途径的 nf-gitemb 信号, 这对发育和免疫是必不可少的。ikk1 磷酸化了其 c 端段上 nf-b2/p100 的特定残留物, 从而导致其加工和 p52 的生成。转录活性 p52:RelB 异质化物的形成引发了对发育信号7、17、18、19、20的缓慢而持续的反应。有趣的是, 中心 nf-b 因子 p52 的生成在很大程度上依赖于另一个因子, nf-b 诱导激酶 (nik)21,22, 但不是 ikk2 或 nemo。在静息细胞中, 由于其持续依赖蛋白酶体的降解23,24, 25,nik的水平仍然很低。在 “非规范” 配体刺激细胞时, 在某些恶性细胞中, nik 变得稳定, 可以招募和激活 ikkgeα. nik 和 ikk1 的激酶活性对于将 p100 有效地处理为 p1007 是必不可少的。ikk1 和 nik 磷化三种丝氨酸 (ser866、870和 872) 的 nf-b2/p100 在其 c-终端段上导致其处理和 p52 的生成。非规范途径的异常激活已涉及到许多恶性肿瘤, 包括多发性骨髓瘤26,27,28。
一些高效和特定的 ikk2/β抑制剂是已知的, 虽然到目前为止没有一个已被证明是一种有效的药物。相反, ikk半特异性抑制剂是稀疏的。这在一定程度上可能是由于我们缺乏关于 ikkniα的结构和生化信息, 这限制了我们对 ikk1 在细胞中激活 nf-b 的机械基础的理解, 以及合理的药物设计。ikk2/β的 x 射线结构为我们提供了关于 ikk2/β29激活机理的见解;然而, 这些结构不能揭示如何不同的上游刺激触发激活 ikk% α或 ikk2/β来调节不同的集合 nf-b 活动30,31。为了了解 ikknα独特信号功能的机制基础, 并建立了一个合理药物设计的平台, 我们重点确定了 ikk半α的结构。
两种相关 ikk 蛋白的生产、结晶及结构解
我们着手确定 ikk半α的 x 射线晶体结构, 并认为这将是一个相对简单的练习, 考虑到我们在 ikk2/ββ蛋白生产、结晶和结构测定方面的经验。然而, 我们感到非常惊讶的是, 这两种相关的蛋白质在结晶的易用性方面表现得非常不同。尽管几个知名实验室做出了努力, ikk1 结构的确定还是用了近20年的时间。这在很大程度上是由于几个关键瓶颈造成?…
The authors have nothing to disclose.
我们感谢位于高级光子源、lemont、il 的 beamlines 19id、24id 和13id 的工作人员在收集各种晶体的数据时提供的支持。我们感谢 salk 研究所 dmitry lyumkis 在 em 地图模型构建的早期阶段为我们获取了低分辨率的低温-em 图, 该模型被用来构建最初的 ikk1 分子替换搜索模型。导致这些结果的研究得到了国家卫生研究院向 gg 提供的 ai064326、ca141722 和 gm071862 赠款的资助。sp 目前是 wellcome 信托 dbt 印度中级研究员。
Cellfectin/Cellfectin II | Thermo Fisher Scientific | 10362100 | Cellfectin is now discontinued, replaced by Cellfectin II |
Sf900 III Insect cell medium | Thermo Fisher Scientific | 12658-027 | |
SF9 cells | Thermo Fisher Scientific | 12659017 | |
anti-IKK1 antibody | Novus Biologicals | NB100-56704 | Previously sold by Imgenex |
anti-PentaHis antibody | Qiagen | 34460 | |
PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Nitrocellulose can also be used |
Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |
Bradford assay reagent | BioRad | 500001 | |
Superdex 200 column | GE Healthcare | 28989335 | |
Amicon concentrator | Millipore | UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024 | |
Compound A | Bayer | ||
Calbiochem IKK-inhibitor XII | Calbiochem | 401491 | |
Staurosporine | SIGMA | S4400 | |
MLN120B | Millenium | Gift item | |
AMPPNP | SIGMA | A2647 | |
Dextran sulfate | SIGMA | 51227, 42867, 31404, | |
Dextran sulfate | Alfa Aesar | J62101 | |
PEG | SIGMA | 93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172 | Some of them are new Cat # on SIGMA catalogue. What we had was originally from Fluka that had different Cat #. |
Crystallization Screens | |||
Crystal Screen I and II (Crystal Screen HT) | Hampton Research | HR2-130 | |
Index HT | Hampton Research | HR2-134 | |
PEG/Ion and PEG/Ion2 (PEG/Ion HT) | Hampton Research | HR2-139 | |
PEGRX 1 and PEGRx 2 (PEGRx HT) | Hampton Research | HR2-086 | |
SaltRx 1 and SaltRx 2 (SaltRx HT) | Hampton Research | HR2-136 | |
Crystal mounts | Hampton Research | HR8-188, 190, 192, 194 | |
Synchrotron | The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory | Beamline 19 ID | The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory provides ultra-bright, high-energy storage ring-generated X-ray beams for research in almost all scientific disciplines. |