準備と膵臓癌細胞と線維芽細胞の共培養を 3 次元回転楕円体の代謝アッセイ

1 膵癌の文化 3 d 回転楕円体による磁気バイオプリンティング 使用標準的な無菌培養技術、培養細胞の適切な成長媒体に 70-80% の confluency に T75 フラスコへの関心の。 。 注: 通常、70-80% コンフルエント T75 フラスコから 5-7 × 10 6 セルを収穫されました。本の研究 – Patu8902 で使用された 2 つの異なる細胞型 (膵腫瘍細胞) と PS1 細胞 (活性化された膵星細胞 21)。ロズウェル パーク記念研究所メディア 1640 (RPMI 1640 年) 10% (v/v) 胎仔牛 serum(FBS)、1 × ペニシリン-ストレプトマイシン (p/s) に両細胞株培養します。 ダルベッコの 5 mL と一度セルを洗う ' s リン酸バッファー saline(DPBS). プラスチックからデタッチ細胞表面 0.05 %2 mL のトリプシンによってトリプシン-EDTA 37 で 5-10 分のため顕微鏡下で細胞の剥離の ° c. チェック。 非アクティブ化トリプシンに 8 mL の成長媒体の添加による分離細胞です。この細胞の健康/生存率に悪影響、trypsinization を避ける。 単一細胞懸濁液を生成してカウントを上下にピペットで移しなさい細胞細胞の密度自動化された細胞カウンターまたは診断を使用します。 一方で、周囲温度に NS のバイアルを平衡します。 は、回転楕円体 (ウェルズ) と新しい 15 mL の円錐管に因数の数をシードに必要な細胞の量を計算します。たとえば、種子全体 96 ウェル 5,000 細胞/ウェル、少なくとも 5.5 × 10 の約数 5 セルのプレートにします。 慎重に 3 分 500 × g で遠心分離による 収集細胞を吸引または、上清をデカントし、1.0 x 10 6 セル/mL の成長媒体の濃度で細胞を再懸濁します。ピペットの広い退屈ピペット先端部がせん断を避けを使って優しく。成長媒体の 550 μ l での 5 セルをたとえば、5.5 × 10 を再懸濁します。 磁化平衡 NS (ステップ 1.6) を使用してセルの希望の金額です。 直接は成長媒体に細胞懸濁液に NS を追加し、軽く振りま 。効率的な細胞の磁気ラベリング、100 μ L 細胞 (1 x 10 の 6 セル/mL で再停止される) あたり 10 μ L NS を使用します 。 注: 典型的な実験のためラベル 5.5 × 10 5 Patu8902 セル 55 μ L NS と 1.1 × 10 550 μ L で 1100 μ L で 6 PS1 細胞 (別売) 110 μ L NS で。 細胞懸濁液を確保するため 軽く反転チューブは、いくつかの回。一時的に、24 ウェル プレートの単一の井戸にセル NS ミックスを転送します。着磁のセル タイプごとに個別にこれを行います。カバー プレートと細胞細胞表面への NS バインドを許可する穏やかな揺れで 2 時間室温でインキュベートします 。 注: 文化と両方の共培養スフェロイドに加えて、Patu8902 や PS1 の単独で細胞から出発の回転楕円体の細胞磁気ドライブ上の印刷が正常に独立にこのメソッドを使用して達成される前に予混合型実験。Patu8902 と PS2 の細胞から培養スフェロイドを生成するためのメソッドは以降の手順で後述します。 やさしく均等にミックスして目的のセル番号を含むマスター ミックスを調製磁化細胞をピペットで移しなさい。回転楕円体を播種量 150 μ L/ウェルの 96 ウェル プレートを調整して (5,000 Patu8902 + 10,000 PS1) 細胞の 15,000 の合計を使用します 。 注: 各ウェルに分配される最終巻使用セル数に関係なく同じをする必要があります。 は、96-well 磁気回転楕円体ドライブ上にセル撥 96 ウェルのプレートを配置し、各ウェルにセル ミックスの 150 μ L を分注します。よく磁石上記の中心にゆっくりと収集細胞を観察します。カバーし、まだ接続されている磁気回転楕円体ドライブと 37 ° C で設定 5% CO 2 インキュベーターで一晩プレートを孵化させなさい。磁気ドライブを取り外し、最大 7 日間のさらなる成長のためインキュベートします 。 注: ドライブ磁気回転楕円体を使用して回転楕円体印刷にセル撥成長板を使用するが重要です。薄く小さい磁石と回転楕円体のドライブを使用することを確認保持ドライブではありません。 は、回転楕円体、毎日の成長を監視します。磁気ドライブを斜めに持ち、使用済みのメディアを引き出すマルチ チャンネル ピペットを使用してマウントされている成長板を配置することによってすべての 3 日間新鮮な成長媒体に補充します 。 注: 共同で 15,000 細胞/ウェル播種 Patu8902 と PS1 のセルは 5-7 日以内 400 600 μ m の直径を持つ 3 D 回転楕円体に成長します。この時点で回転楕円体は代謝特性、薬の評価、およびその他のダウン ストリーム アプリケーションの準備ができている。 2。細胞外のフラックス アナライザーを使用して生体エネルギー経路の 3 D 膵腫瘍回転楕円体の代謝アッセイ 注: このセクションでは、細胞外のフラックスを用いた回転楕円体の代謝機能の分析で3 D 回転楕円体のために特別に設計されたアッセイ プレートとアナライザーを説明。 洗濯と回転楕円体からへの転送成長板回転楕円体アッセイ プレート 。 注: 〜 500 μ m の直径に到達するとき、回転楕円体は代謝アッセイに使用可能性があります。 アッセイを実行する前に日は、用意されているユーティリティ板の試金 calibrant (200 μ L/ウェル) とプローブまたはセンサー カートリッジを水和物し、インキュベート 37 で設定 (非 CO 2) 加湿のインキュベーターで一晩 (4 18 h) ° C メディアの準備、適切な試金必要な代謝アッセイの基本メディア (材料の表を参照) を補うことでいずれか 2 mM L グルタミン解糖ストレス テスト (GST) のアッセイまたは 1 mM ピルビン酸、L-グルタミン 2 mM と 10 mM のグルコース、ミトコンドリア ストレス テスト (MST) アッセイ 。 注: 細胞フラックス アナライザーは、ミトコンドリア呼吸 (OCR) と 96 ウェル プレート形式で生きた細胞の解糖作用 (ecar と) の両方を測定します。これらの料金は、細胞の代謝機能の調査の下でサンプルの概要を示します。詳細についてはアッセイ キットのマニュアルを参照してください。 (ステップ 2.1.1 参照) の特定のサプリメントをアッセイを追加後、補われたアッセイ 37 ° C の水浴中に暖かいし、7.4 ± 0.1 0.1 n とする pH 調整水酸化ナトリウム。媒体を使用するまで保温します。 西川アッセイ キット試薬推奨ストック濃度校正アッセイ中です 。 注: これらは作られて 10 × で井戸に望まれる最終濃度。グルコース、オリゴマイシンおよび 2-デオキシ-グルコース (2 DG) のストック濃度が 100 mM、100 μ M、500 ミリメートル、それぞれします。 回転楕円体と全体的な均一性; 形状と一部鉄骨をチェックする 光の下で成長板の観察を回転楕円体顕微鏡スフェロイドの e. 磁気保持ドライブに成長板を転送し、慎重に 〜 120 μ L 成長媒体を吸引します。優しく暖め、事前に校正されたアッセイ メディアの ~ 120 μ L で回転楕円体を洗う、吸引し、洗浄を 2 回繰り返します。回転楕円体は、洗い流されなかったことを確認をもう一度顕微鏡下で回転楕円体を検査します。 180 μ L 暖かいアッセイ メディアを各ウェルに追加することで楕円体アッセイ プレートを準備します。 は、P20 マイクロ ピペットを 10 μ L に設定し、フィットのそれに広く退屈ヒント。きれいなハサミやメス穴を広げると通常のピペット チップの先端カット ワイド退屈ヒントが利用できない場合 。 注: これはせん断を減らす必要があります、アッセイ プレートに転送されている間、回転楕円体の全体的な形態を保持します。 は、回転楕円体の転送を実行する暖かい (37 ° C) 表面を使用します。コントラストを高めるし、転送処理中に回転楕円体の可視化を支援する白色ランプで温めた x 線フィルム ビューアー表面を使用します。 慎重に広い装備 P20 マイクロ ピペットを使用してセル撥成長板から単一中古洗浄回転楕円体吸引穴先端と優しく転送回転楕円体、代謝を行うための回転楕円体アッセイ プレートの各ウェルのセンターに直接試金。アッセイ プレートを作成する純粋な重力によって各ウェルのマイクロ大広間にそっと落ちる各回転楕円体を許可します 。 注: それは通常井戸の中心に重力によって落ちる各回転楕円体のため 5-8 秒をかかります。スフェロイドはマイクロ室に定住しているまでピペットを引っ張らないでください。行うこれらアッセイ プレート (A1、A12、H1、H12) の 4 隅の井戸でない預金回転楕円体は背景井戸として使用されます。 は、各回転楕円体に確実に各井戸の中心に各回転楕円体の位置や形態を監視します。重力によって必要に応じて、ワイドを使用して回転楕円体を吸引によって井戸の中心に位置穴ピペット先端部と後続の成膜します。 すべて回転楕円体が転送されている, 一度試金する 1 時間前の 37 ° C 加湿空気インキュベーター (非 CO 2) でアッセイ プレートを配置します。 化合物とアッセイを行うセンサー カートリッジ 準備 10 × 2.1.2 の手順に従って分析特定のメディアに特定のアッセイ試薬を集中して。たとえば、GST を遂行する分析書に推奨されるボリュームの 2 DG、オリゴマイシン、ブドウ糖を再構築します。GST と MST の試金は Patu8902 PS1 回転楕円体を用いて行った。 は正しくセンサー カートリッジを左側の A ~ H のラベルの行を持つオリエントし、センサー カートリッジ上に読み込みガイドを配置します。ロードするポートに対応する文字が左上隅にくるようにローディング ガイドを定位によって目的のポートの正しい読み込みを確実します。 注入ポートに直接試薬を分注マルチ チャンネル ピペットを使用しています。プロシージャ全体で指先を使用して位置に読み込みガイドを保持します 。 注: 各試薬は、分析書記載推奨ポートに挿入されます。空気の泡の作成を避けるため、空気の泡を削除するカートリッジの任意の部分をタップしないようにします。 ロード ガイドとカートリッジと目の高さの位置に荷を積むため注入ポートを目視で確認する削除します。 セクション 2.3 で説明されているように音源コント ローラー波ソフトウェア (今後、解析ソフトウェア) を使用して実験的アッセイ デザイン/楽器のプロトコルを作成します。 試金のデザインと解析ソフトウェアを使用して実行 実験のための試金テンプレートの作成 解析ソフトウェアを開きをクリックして " テンプレート " または既存の試金から選択テンプレートです。ダブルクリックして " 空白のテンプレート ". を定義する実験的グループおよび条件。 ポート A、B、および C. を残すのため注入の定義戦略ポート D 空 。 注意: GST の試金のためこれらのポートのみがグルコース、オリゴマイシン 2 DG と読み込まれます。ロテノン、FCCP オリゴマイシン MST アッセイの場合を読み込まれます。 定義前処理回転楕円体は、1 つまたは複数のテスト混合物および制御グループと扱われた場合。ソース、サプリメント、その他の情報など、アッセイ メディアを定義します。 密度および通路番号の情報を見て 1 つまたは複数のセル型 (例: Patu8902、PS1) を定義します。 をクリックして " グループの生成 ". をクリックして " プレート マップ " タブし、実験的なデザインに対応するアッセイ プレートにグループを割り当てます。 は、バック グラウンド井戸として 4 つのコーナーの井戸を選択します。これらの井戸の回転楕円体がないことを確認します。 アナライザーで分析を実行 計測器プロトコル タブをクリックしてチェックして既定プロトコル コマンドそのまま " 調整 "、" Equilibrate " と " ベースライン測定サイクル ". クリック " 注射 " し、各ポートの化合物を定義します。測定サイクル 6 サイクルから編集既定の回転楕円体のための 3 つのサイクル。デフォルト 3 分ミックス、0 分の待ち時間 3 分測定時間を維持します 。 注: 既定のメジャー ミックス待機時間、3 分、0 分、3 分、それぞれ。3 つの基底率測定は最初試金化合物の注入の前に通常されます。これらの測定値をキャリブレーションし、実験的なデザインによって再調整することができます。 プロトコルとグループの概要を確認します。 アッセイ デザイン テンプレートを保存します。 試金基板を注入ポートが読み込まれると、は事前測定校正に進みます。細胞外フラックス アナライザーにユーティリティ プレート付きカートリッジを転送します 。 注: この通常 15-20 分以内に完了、OCR と ecar と測定センサーをキャリブレーションします。 カートリッジのキャリブレーション後 3 D 回転楕円体を含む予め温めておいたアッセイ プレートとユーティリティ プレートを交換し、分析を開始します。測定が完了したら、データをスプレッドシートやグラフと統計ソフトウェアのデータを分析にエクスポートします。