Summary

Un système hybride de levure modifié pour les études d'interaction complexe-ADN de protéines hétérogènes

Published: July 24, 2017
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Summary

L'essai à un hybride de levure modifié décrit ici est une extension de l'essai à base d'hybride (Y1H) de levure classique pour étudier et valider l'interaction de l'ADN-complexe hétérologue-ADN dans un système hétérologue pour toute étude de la génomique fonctionnelle.

Abstract

Au cours des années, le dosage de la levure à un hybride s'est avéré être une technique importante pour l'identification et la validation des interactions physiques entre les protéines telles que les facteurs de transcription (TF) et leur cible d'ADN. La méthode présentée ici utilise le concept sous-jacent du Y1H mais est encore modifiée pour étudier et valider les complexes de protéines qui se lient à leur ADN cible. Par conséquent, on appelle l'essai à base d'un hybride (Y1.5H) de levure modifiée. Ce dosage est rentable et peut être effectué facilement dans un environnement de laboratoire régulier. Bien que l' utilisation d'un système hétérologue, la méthode décrite pourrait être un outil précieux pour tester et valider la liaison du complexe de protéines hétéromériques à leur (s) cible (s) d'ADN pour la génomique fonctionnelle dans tout système d'étude, en particulier la génomique végétale.

Introduction

En général, pour comprendre les interactions protéine-ADN, le dosage Y1H est le système préféré utilisé avec succès dans un laboratoire 1 . Le dosage basique de Y1H implique deux composants: a) une construction rapporteur avec un ADN d'intérêt cloné avec succès en amont d'un gène codant pour une protéine rapporteur; Et b) une construction d'expression qui générera une protéine de fusion entre le TF d'intérêt et un domaine d'activation de la transcription de la levure (AD). L'ADN d'intérêt est généralement appelé «appât» tandis que la protéine de fusion est connue sous le nom de «proie». Au cours des dernières années, des versions multiples du test Y1H ont été développées pour répondre à des besoins spécifiques avec leurs propres avantages 2 . Le test Y1H existant peut être mis en œuvre avec succès pour identifier et valider l'interaction d'une protéine à la fois avec son appât d'ADN, mais n'a pas la capacité d'identifier les interactions protéines-ADN hétérodimères ou multimériques.

"> La méthode décrite ici est une version modifiée du Y1H permettant aux chercheurs d'étudier simultanément plusieurs protéines se liant à leurs séquences d'ADN cible. L'objectif de ce dosage est d'exprimer la protéine d'intérêt avec un domaine d'activation (pDEST22: TF) et évaluer l'activation des régions d'ADN candidates fusionnées à un journaliste en présence et / ou en l'absence du partenaire protéinant interactif (pDEST32ΔDBD-TF) dans le système de levure. Ce dosage nous permettra de déterminer si l'interaction entre ces deux Les protéines sont nécessaires pour l'activation de la cible. Il s'agit d'un système compatible de clonage GATEWAY et donc possible d'utiliser dans un environnement de laboratoire régulier. Ce protocole est basé sur une transformation directe, ce qui facilite la co-transformation de différents TF dans un système de levure . Ainsi, il s'agit d'une stratégie avantageuse pour valider les complexes de protéines qui se lient à leurs cibles d'ADN possibles pour la validation moléculaire et fonctionnelle in vitro fOu tout système. Les techniques actuelles telles que les méthodes de purification par affinité Tandem (TAP) sont coûteuses et nécessitent beaucoup de main-d'œuvre, mais permettent de détecter des protéines hépatiques à grande échelle 3 , 4 , 5 . Cette levure modérée à un hybride peut être exécutée avec succès dans un calcul de laboratoire régulier sur une petite échelle ( figure 1 ) et est également rentable. Le test Y1.5H peut aider les chercheurs de la communauté à tester et à valider leur hypothèse afin de définir le rôle de la liaison du complexe de protéines multimériques à une cible d'ADN commune en utilisant un système hétérologue. Sur la base des résultats, l'hypothèse pourrait être validée in vivo dans le système d'étude préféré. Récemment, nous avons utilisé cette approche pour définir le rôle d'un TF et son mode d'action pour réguler la floraison dans Arabidopsis 6 .

Protocol

1. Préparation des plasmides de construction et de rapporteurs La PCR amplifie les régions promoteurs / "fragments" (de préférence ~ 250 – 500 pb) de l'ADN cible à analyser pour un clonage supplémentaire dans le vecteur d'entrée en utilisant E. coli (TOP10). Lors de la confirmation de séquençage, sous-clone le clone positif dans un vecteur d'expression pGLacZi compatible 7 comme décrit précédemment 8 <su…

Representative Results

La procédure générale de mise en place des plaques pour la co-transformation des régions d'ADN dans les cellules de levure avec une protéine d'intérêt ( figure 2 ). La configuration de la plaque peut être modifiée en fonction de la nécessité de l'expérience et du nombre de régions / fragments d'ADN testés. Après le jour 5 du protocole, une plaque bien cultivée et positive devrait être visible comme dans la <strong class="xfig…

Discussion

La procédure standard Y1H existante est appropriée pour identifier une proie protéique unique se liant à son appât d'ADN. Avec diverses modifications techniques, le système existant a été exploité pour définir les réseaux réglementaires transcriptionnels. Cependant, les TF sont connus pour fonctionner comme une partie des complexes impliquant deux ou plusieurs TF ou protéines, avec seulement une partie du TF capable de se lier à l'ADN. Les protéines ou TF qui ne possèdent que les domaines de liai…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions SS Wang, M. Amar et A. Galla pour la lecture critique du manuscrit. La recherche rapportée dans cette publication a été soutenue par l'Institut national des sciences médicales générales des Instituts nationaux de la santé selon les numéros de récompense RO1GM067837 et RO1GM056006 (à SAK). Le contenu relève uniquement de la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des instituts nationaux de la santé.

Materials

pDEST22 vector Invitrogen PQ1000101 Pro-Quest Two hybrid system kit
pDEST32delatDBD Invitrogen PQ1000102 Pro-Quest Two hybrid system kit; this vecor is modified. It is pDEST32 minus DNA binding Domain
pENTR/D-TOPO Cloning Kit Invitrogen K240020
YM4271 Strain Clontech K1603-1 MATCHMAKER One-Hybrid System
pEXP-AD502 Invitrogen PQ1000101 Pro-Quest Two hybrid system kit
GATEWAY LR Clonase II enzyme mix Invitrogen 11791020
YPDA media Clontech 630410
SD-Agar Clontech 630412
SD minimal media Clontech 630411
Uracil DO Supplement Clontech 630416
Tryptophan Do Supplement Clontech 630413
Tris Base Fisher Scientific BP152-1
EDTA Fisher Scientific S311-500
LiAc Sigma-Aldrich L4158
Saplmon Sperm (10mg/ml) Invitrogen 15632011
96 well round bottom Plate Greiner bio-one 650101
PEG3350 Sigma-Aldrich 1546547
96-deep well block USA Scientific 1896-2000
Sealable Foil USA Scientific 2923-0110
Araseal Excel Scientific B-100
2-mercaptoethanol Fisher Scientific 034461-100
ONPG Sigma-Aldrich 73660
Na2CO3 Sigma-Aldrich 223484
Na2HPO4  Sigma-Aldrich S3264
NaH2PO4  Sigma-Aldrich S3139
KCL Fisher Scientific BP366-500
MgSO4  Sigma-Aldrich 83266
HCL Fisher Scientific SA54-4
Drybath Thermo Fischer
Voretx Thermo Fischer
Centrifgue Eppendorf Centrifuge 5810R
Plate Reader Molecular Device SPECTRAMAX PLUS Microplate Spectrophotometer
Incubator Thermo Fisher Model No. 5250- 37 Degree, 6250-30 degrees
Shaker Incubator New Brunswick
Water Bath Thermo Fisher IsoTemp 205
Puncher
50 ml Falocn BD Falcon
Beaker Nalgene
Flask Nalgene
Petriplates (150mm) Greiner bio-one

Referenzen

  1. Saghbini, M., Hoekstra, D., Gautsch, J. Media formulations for various two-hybrid systems. Methods Mol Biol. 177, 15-39 (2001).
  2. Reece-Hoyes, J. S., Marian Walhout, A. J. Yeast one-hybrid assays: A historical and technical perspective. Methods. 57 (4), 441-447 (2012).
  3. Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).
  4. Puig, O., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
  5. Gavin, A. -. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
  6. Tripathi, P., Carvallo, M., Hamilton, E. E., Preuss, S., Kay, S. A. Arabidopsis B-BOX32 interacts with CONSTANS-LIKE3 to regulate flowering. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (1), 172-177 (2017).
  7. Helfer, A., et al. LUX ARRHYTHMO encodes a nighttime repressor of circadian gene expression in the Arabidopsis core clock. Curr Biol : CB. 21 (2), 126-133 (2011).
  8. Pruneda-Paz, J. L., et al. A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors. Cell Rep. 8 (2), 622-632 (2014).
  9. Wanke, D., Harter, K. Analysis of Plant Regulatory DNA sequences by the Yeast-One-Hybrid Assay. Methods Mol Biol. 479, 291-309 (2009).
  10. Klein, P., Dietz, K. -. J. Identification of DNA-Binding Proteins and Protein-Protein Interactions by Yeast One-Hybrid and Yeast Two-Hybrid Screen. Methods Mol Biol. 639, 171-192 (2010).
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  13. Deplancke, B., Dupuy, D., Vidal, M., Walhout, A. J. M. A gateway-compatible yeast one-hybrid system. Genome Res. 14 (10B), 2093-2101 (2004).

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Diesen Artikel zitieren
Tripathi, P., Pruneda-Paz, J. L., Kay, S. A. A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies. J. Vis. Exp. (125), e56080, doi:10.3791/56080 (2017).

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