Summary

Rescate y Caracterización del Virus Recombinante de un Nuevo Mundo Zika Virus Infectious Clone

Published: June 07, 2017
doi:

Summary

Este protocolo describe la recuperación del virus Zika infeccioso a partir de un clon de ADNc infeccioso de dos plásmidos.

Abstract

Los clones de cDNA infecciosos permiten la manipulación genética de un virus, facilitando así el trabajo sobre vacunas, patogénesis, replicación, transmisión y evolución viral. Aquí se describe la construcción de un clon infeccioso para el virus Zika (ZIKV), que actualmente está causando un brote explosivo en las Américas. Para evitar la toxicidad a las bacterias que se observa comúnmente con los plásmidos derivados de flavivirus, se generó un sistema de dos plásmidos que separa el genoma en el gen NS1 y es más estable que las construcciones de longitud completa que no pudo ser recuperado con éxito sin mutaciones. Después de la digestión y la ligación para unir los dos fragmentos, ARN viral de longitud completa puede ser generado por transcripción in vitro con ARN polimerasa T7. Tras la electroporación del ARN transcrito en las células, se recuperó el virus que exhibía cinética de crecimiento in vitro similar y fenotipos de virulencia e infección in vivo en ratones y mosquitos, respectivamente.

Introduction

El virus Zika (ZIKV, Familia Flaviviridae : Género Flavivirus ) es un flavivirus transmitido por mosquitos que llegó a Brasil en 2013-14 y posteriormente se asoció con un brote masivo de enfermedad febril que se extendió a través de las Américas 1 . Además, ZIKV se ha relacionado con graves resultados de la enfermedad, como el síndrome de Guillain-Barré en adultos y microcefalia en fetos y neonatos [ 2] . Poco se sabía acerca de ZIKV antes de su rápida propagación en el hemisferio occidental. Esto incluyó la falta de herramientas moleculares, dificultando así la investigación mecanicista. Las herramientas moleculares para los virus, como los clones de cDNA infecciosos, facilitan el desarrollo terapéutico de las vacunas y antivirales y permiten la evaluación de factores genéticos virales relacionados con la patogénesis viral diferencial, la respuesta inmune y la evolución viral.

Se sabe que los clones infecciosos de flavivirus son altamente inestables en bacterias debido a crY promotores prokaryotic yptic presentes en sus genomas 3 . Se han utilizado varios enfoques para mitigar este problema; Incluyendo la inserción de repeticiones en tándem aguas arriba de las secuencias víricas 4 , mutación de las secuencias putativas del promotor procariótico 5 , división del genoma en múltiples plásmidos 6 , vectores de bajo número de copias (incluidos los cromosomas artificiales bacterianos) 7 , 8 e inserción de intrones en el genoma viral 9 . Se ha descrito un sistema de longitud completa sin modificaciones para ZIKV; Sin embargo, este clon parecía estar atenuado en cultivo celular y en ratones 10 . Otros grupos han introducido intrones en el genoma ZIKV, permitiendo la interrupción de secuencias inestables en bacterias que pueden ser empalmadas en células de mamíferos in vitro para la producción de virus infeccioso 11, 12 . Además, se ha utilizado con éxito un sistema basado en PCR denominado Infectious Subgenomic-Amplicons para rescatar la cepa MR766 de ZIKV 13 . El enfoque aquí descrito no requiere secuencias foráneas, sino que altera el genoma en la región de alta inestabilidad mediante el uso de múltiples plásmidos, que se ha utilizado previamente con éxito con la fiebre amarilla 6 , dengue 14 , 15 y virus del Nilo Occidental 16 . Además, la adición de la secuencia de ribozima de hepatitis D en los extremos genómicos víricos facilita la creación de un extremo 3 'auténtico sin la necesidad de la adición de un sitio de linealización. Además, ambos plásmidos se construyen en un vector de número de copias bajas (pACYC177, ~ 15 copias por célula) para mitigar cualquier toxicidad residual 17 . El virus recuperado muestra un perfil de crecimiento comparable alParental en curvas de crecimiento in vitro en 8 líneas celulares que comprenden una variedad de tipos de células derivadas de mamíferos e insectos, y ha exhibido perfiles patógenos idénticos en ratones y tasas de infección, diseminación y transmisión en mosquitos 18 .

En el presente documento, detallamos un protocolo que describe cómo cultivar los plásmidos de clones infecciosos, genera ARN viral de longitud completa (el genoma viral) in vitro y recupera el virus infeccioso en cultivo celular. En primer lugar, se describe la propagación de los plásmidos en bacterias o sin bacterias de amplificación mediante amplificación de círculo de rodadura (RCA). A continuación, se muestra cómo se digieren los dos plásmidos y luego se ligan entre sí para generar el virus de longitud completa. Por último, se describe la producción de ARN transcrito y su posterior electroporación en células Vero, seguido de la valoración del virus recuperado ( Figura 1 ]. El enfoque descrito es rápido,R recuperación de las poblaciones de virus infecciosos en 1-2 semanas.

Protocol

1. Transformación y recuperación de plásmidos de clones infecciosos Transformar ambos plásmidos (por separado) utilizando un protocolo de transformación comercial ( por ejemplo , NEB 5 Minute Transformation Protocol) con algunas modificaciones. Ambos plásmidos contienen un gen que codifica la resistencia a ampicilina, por lo tanto, usan ampicilina o carbenicilina para la selección. Se prefiere la carbenicilina, ya que es más estable. Retirar las células (ver tabla d…

Representative Results

El protocolo descrito aquí permite la recuperación de virus Zika derivados de clones infecciosos. Manipular el sistema de clones infecciosos de dos plásmidos es sencillo cuando se realiza con cuidado, en comparación con las versiones de longitud completa que son altamente inestables (datos no mostrados). Después de la digestión y la ligación de las dos piezas distintas, ARN tapado se produce utilizando la transcripción in vitro con T7 polimerasa que luego se ele…

Discussion

Here we describe a method for the recovery of a bipartite infectious cDNA clone system for ZIKV. Previously described clones for ZIKV suffer from either attenuation or require the addition of introns, making plasmids larger and preventing rescue in insect cells. Infectious virus can be recovered using the two-plasmid clone system in either mammalian or insect cells (data not shown). In addition, virus recovered from this system behaves similarly to wild-type virus in several cell lines, in an immunocompromised mouse mode…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores desean agradecer a Kristen Bullard-Feibelman, a Milena Veselinovic ya Claudia Rückert por su ayuda en la caracterización del virus derivado de clones. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas, NIH bajo las concesiones AI114675 (BJG) y AI067380 (GDE).

Materials

NEB Stable CompetentE. coli New England BioLabs C3040H
Carbenicillin, Disodium Salt various
Zyppy Plasmid Miniprep Kit Zymo Research D4036
ZymoPURE Plasmid Maxiprep Kit Zymo Research D4202
SalI-HF New England BioLabs R3138S 20,000 units/ml
NheI-HF New England BioLabs R3131S 20,000 units/ml
ApaLI New England BioLabs R0507S 10,000 units/ml
EcoRI-HF New England BioLabs R3101S 20,000 units/ml
BamHI-HF New England BioLabs R3136S 20,000 units/ml
HindIII-HF New England BioLabs R3104S 20,000 units/ml
illustra TempliPhi 100 Amplification Kit GE Healthcare Life Sciences 25640010
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Macherey-Nagel 740609.5
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) New England BioLabs M0371S 1,000 units/ml
Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) New England BioLabs M0290S 10,000 units/ml
T4 DNA Ligase New England BioLabs M0202S 400,000units/mL
HiScribe T7 ARCA mRNA Kit New England BioLabs E2065S
Vero cells ATCC CCL-81
ECM 630 High Throughput Electroporation System BTX 45-0423 Other machines are acceptable.
LB Broth with agar (Miller) Sigma L3147 Can be homemade as well.
Terrific Broth Sigma T0918 Can be homemade as well.
Petri Dish Celltreat 229693
Culture Tubes VWR International 60818-576
T75 flasks Celltreat 229340
T182 flasks Celltreat 229350
1x PBS Corning 21-040-CV
RPMI 1640 with L-glutamine Corning 10-040-CV
DMEM with L-glutamine and 4.5 g/L glucose Corning 10-017-CV
Fetal Bovine Serum (FBS) Atlas Biologicals FP-0500-A
Tragacanth Powder MP Bio MP 104792
Crystal Violet Amresco 0528-1006
Ethanol Denatured VWR International BDH1156-1LP
6 well plate Celltreat 229106
12 well plate Celltreat 229111
Sequencing Oligos IDT see table 1
Qubit 3.0 ThermoFisher Qubit 3.0 other methods are acceptable.
Qubit dsDNA BR Assay Kit ThermoFisher Q32850 other methods are acceptable.
Qubit RNA HS Assay Kit ThermoFisher Q32852 other methods are acceptable.
Class II Biosafety Cabinet Varies N/A This is necessary for live-virus work.

Referenzen

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Diesen Artikel zitieren
Weger-Lucarelli, J., Duggal, N. K., Brault, A. C., Geiss, B. J., Ebel, G. D. Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone. J. Vis. Exp. (124), e55857, doi:10.3791/55857 (2017).

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