Summary

Гипоксическое предварительное кондиционирование клеток-предшественников, полученных из костного мозга, в качестве источника для генерации зрелых клеток Шванна

Published: June 14, 2017
doi:

Summary

Стромальные клетки костного мозга (MSC) с нейронным потенциалом существуют в костном мозге. Наш протокол обогащает эту популяцию клеток посредством гипоксической предварительной кондиции и после этого направляет их на зрелые клетки Шванна.

Abstract

В этой рукописи описывается средство обогащения для нейронных предшественников из популяции стромальных клеток костного мозга (MSC), а затем для направления их в зрелую судьбу клеток Шванна. Мы подвергли крысам и человеческим MSCs переходные гипоксические условия (1% кислорода в течение 16 часов), а затем расширение в виде нейросферов на субстрате с низкой степенью присоединения с добавлением фактора роста эпидермального фактора роста (EGF) / основного фибробласта (bFGF). Нейросферы высевали на поликультурный пластик, покрытый поли-D-лизином / ламинином, и культивировали в глиогенном коктейле, содержащем β-Heregulin, bFGF и тромбоцитарный фактор роста (PDGF) для генерации клеточных клеток Schwann (SCLC). SCLC были направлены на участие судьбы через сокультуру в течение 2 недель с очищенными нейронами дорзальных корневых ганглиев (DRG), полученными от E14-15 беременных крыс Sprague Dawley. Зрелые клетки Шванна демонстрируют стойкость в экспрессии S100β / p75 и могут образовывать миелиновые сегменты. Клетки, генерируемые таким образом, имеют потенциалПри трансплантации аутологичных клеток после травмы спинного мозга, а также при моделировании заболеваний.

Introduction

Трансплантация нейронных предшественников и их производных обещает быть стратегией лечения после травматического повреждения нерва 1 , 2 и нейродегенерацией 3 , 4 . Перед клиническим применением важно обеспечить: i) способ доступа и расширения на аутологичный источник клеток стебля / предшественника и ii) средство для направления их к соответствующим зрелым типам клеток 3 . Наш интерес к клеточной терапии для повреждения спинного мозга привел нас к поиску надежного, аутологичного источника клеток нервных предшественников из тканей взрослых.

Субпопуляция MSC происходит от нервного гребня и легко доступна из полости костного мозга. Эти клетки представляют собой нейронные предшественники, которые могут генерировать нейроны и глии 5 . Модели животных церебральной ишемии демонстрируют, что гипоксия способствует распространению Итерации и мультипотенции нейронных предшественников в мозге 6 . Это было основанием для использования гипоксического предварительного кондиционирования в качестве средства расширения на мозговых нейронных предшественниках.

Трансплантация клеток Шванна в поврежденный спинной мозг способствует регенерации 2 . SCLC могут быть получены из MSC посредством добавления глиогенных факторов ( то есть β-Heregulin, bFGF и PDGF-AA), но демонстрируют фенотипическую нестабильность. После отмены факторов роста они возвращаются к фибробластоподобному фенотипу 7 . Фенотипическая нестабильность нежелательна при трансплантации клеток из-за риска аберрантной дифференциации и канцерогенеза. Поскольку предшественники клеток Шванна связаны с расслоениями аксонов внутри эмбрионального периферического нерва 8 , мы были вовлечены в SCLC с культивированием с очищенными эмбриональными нейронами DRG 7 ,Ass = "xref"> 9. Результирующие зрелые клетки Шванна подвергаются суждению и демонстрируют функцию in vitro 7 , 9 и in vivo 10 .

Наш протокол по обогащению нейронных предшественников из MSC прост и эффективен и приводит к увеличению числа клеток для последующих анализов. Вывод суицидальных клеток Шванна через платформу кокультуры позволяет изучать глиальную дифференциацию и генерировать стабильные и функциональные клетки Шванна для потенциального клинического применения.

Protocol

Все процедуры, связанные с животными, проводились в строгом соответствии с Руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных и одобрены Комитетом по использованию живых животных для обучения и исследований, Медицинский факультет Ли Ка Шинг, Университет Гонконга. Образцы …

Representative Results

Обзор основных этапов нашего протокола показан на рисунке 1 . Таким образом, крысиные и человеческие MSC выбираются путем прилипания к пластике тканевой культуры. Расширенные MSC предопределены гипоксией и затем подвержены условиям формирования нейросф…

Discussion

Крайне важно сохранить «стебельность» MSC до обогащения нейронных предшественников посредством гипоксической предварительной кондиции и культуры нейросферы. По нашему опыту, мультипотентные MSC могут быть надежно идентифицированы по их удлиненной фибробластоподобной морфологии. Нап…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы хотели бы поблагодарить доктора Най-Су Вонга за предоставление аппаратуры для гипоксии и г-жи Алисы Луи за техническую поддержку.

Materials

αMEM Sigmaaldrich M4526
DMEM/F12 Thermofisher scientific 12400-024
Neurobasal medium Thermofisher scientific 21103-049
FBS Biosera FB-1280/500
B27 Thermofisher scientific 17504-001
Epidermal growth factor (EGF) Thermofisher scientific PHG0313
Basic fibroblast growth factor (bFGF)  Peprotech 100-18B/100UG
Nerve growth factor (NGF)  Millipore NC011
Platelet-derived growth factor-AA (PDGF-AA) Peprotech 100-13A
Heregulin beta-3, EGF domain (β-Her) Millipore 01-201
Uridine Sigmaaldrich U3003
5-Fluro-2' – deoxyuridine (FDU) Sigmaaldrich F0503
Poly-D-lysine (PDL) Sigmaaldrich P7886-1G
Laminin Thermofisher scientific 23017015
GlutaMAX Thermofisher scientific 35050061
Penicillin / streptomycin (P/S) Thermofisher Scientific 15140-122
TrypLE Express Thermofisher Scientific 12604-013
10 cm plate for adherent culture TPP 93100 Used for selection of MSCs by tissue culture adherence
6-well plate for adherent culture TPP 92006 Used for expansion of MSCs following passaging
UltraLow 6-well plate for non-adherent culture Corning 3471 Used for neural progenitor enrichment
anti-human CD90(Thy-1) BD Biosciences 555593
anti-human CD73 BD Biosciences 550256
anti-human/rat STRO-1 R&D Systems MAB1038
anti-human nestin R&D Systems MAB1259
anti-human CD45 BD Biosciences 555480
anti-rat CD90(Thy-1) BD Biosciences 554895
anti-rat CD73 BD Biosciences 551123
anti-rat nestin BD Biosciences MAB1259
anti-rat CD45 BD Biosciences 554875
Anti-S100β Dako Z031101
Anti-p75 Millipore MAB5386
Anti-GFAP Sigmaaldrich G3893
Anti-Class III-beta tubulin (Tuj-1) Covance MMS-435P
Anti-Human nuclei Millipore MAB1281
Hypoxia chamber Billups-Rothenberg MIC-101
HEPES buffer Sigmaaldrich H4034-100G

Referenzen

  1. Wiliams, R. R., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation: a repair strategy for spinal cord injury?. Prog Brain Res. 201, 295-312 (2012).
  2. Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation for spinal cord injury repair: its significant therapeutic potential and prospectus. Rev Neurosci. 26 (2), 121-128 (2015).
  3. Lindvall, O., Kokaia, Z. Stem cells in human neurodegenerative disorders–time for clinical translation?. J Clin Invest. 120 (1), 29-40 (2010).
  4. Terzic, D., et al. Directed Differentiation of Oligodendrocyte Progenitor Cells From Mouse Induced Pluripotent Stem Cells. Cell Transplant. 25 (2), 411-424 (2016).
  5. Takashima, Y., et al. Neuroepithelial cells supply an initial transient wave of MSC differentiation. Cell. 129 (7), 1377-1388 (2007).
  6. Felling, R. J., et al. Neural stem/progenitor cells participate in the regenerative response to perinatal hypoxia/ischemia. J Neurosci. 26 (16), 4359-4369 (2006).
  7. Shea, G. K., Tsui, A. Y., Chan, Y. S., Shum, D. K. Bone marrow-derived Schwann cells achieve fate commitment–a prerequisite for remyelination therapy. Exp Neurol. 224 (2), 448-458 (2010).
  8. Jessen, K. R., Mirsky, R. The origin and development of glial cells in peripheral nerves. Nat Rev Neurosci. 6 (9), 671-682 (2005).
  9. Mung, K. L., et al. Rapid and efficient generation of neural progenitors from adult bone marrow stromal cells by hypoxic preconditioning. Stem Cell Res Ther. 7 (1), 146 (2016).
  10. Ao, Q., et al. The regeneration of transected sciatic nerves of adult rats using chitosan nerve conduits seeded with bone marrow stromal cell-derived Schwann cells. Biomaterials. 32 (3), 787-796 (2011).
  11. Tondreau, T., et al. Isolation of BM mesenchymal stem cells by plastic adhesion or negative selection: phenotype, proliferation kinetics and differentiation potential. Cytotherapy. 6 (4), 372-379 (2004).
  12. Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).
  13. Jirsova, K., Sodaar, P., Mandys, V., Bar, P. R. Cold jet: a method to obtain pure Schwann cell cultures without the need for cytotoxic, apoptosis-inducing drug treatment. J. Neurosci. Methods. 78 (1-2), 133-137 (1997).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Tsui, Y., Mung, A. K., Chan, Y., Shum, D. K., Shea, G. K. Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells As a Source for the Generation of Mature Schwann Cells. J. Vis. Exp. (124), e55794, doi:10.3791/55794 (2017).

View Video