Summary

Kurbağa ve Zebra balığı Embriyolarında Hipoksinin İndüklenmesi

Published: June 26, 2017
doi:

Summary

Kurbağa ve zebra balığı embriyoları gibi suda yaşayan organizmalar için yeni bir hipoksik oda sistemi sunuyoruz. Sistemimiz basit, sağlam, düşük maliyetlidir ve in vivo ve 48 saate kadar hipoksinin indüklenmesine ve sürülmesine izin verir. Hipoksinin etkinliğini izlemek için tekrarlanabilir 2 yöntem sunmaktayız.

Abstract

Burada, kurbağa ve zebra balığı embriyoları gibi su organizmalarında hipoksinin etkilerini incelemek için geliştirdiğimiz hipoksi indüksiyonu için yeni bir sistem sunuyoruz. Sistemimiz, seçime bağlı herhangi bir deneysel solüsyonda spesifik bir oksijen konsantrasyonunu ve sıcaklığını sağlamak ve korumak için sağlam olan basit bir düzen içeren bir hazneyi içermektedir. Sunulan sistem çok uygun fakat son derece fonksiyoneldir, in vivo doğrudan deneyler için ve 48 saate kadar çeşitli zaman periyodlarında indüksiyon ve hipoksinin sürdürülmesine izin verir.

Hipoksinin etkilerini izlemek ve incelemek için iki yöntem kullandık – tüm embriyolar veya spesifik dokularda hipoksi ile uyarılabilir faktör 1alfa (HIF-1α) seviyelerinin ölçülmesi ve retinal kök hücre çoğalmasının belirlenmesinde 5-etinil-2'- Deoksiuridin (EdU) DNA'ya dahil edilmesi. HIF-1α seviyeleri tüm embriyo veya dokuda genel hipoksi belirteci olarak görev yapabilirBurada, embriyonik retina seçimi. Embriyonik retinanın çoğalan hücrelerine EdU'nun dahil edilmesi hipoksi indüksiyonunun spesifik bir çıktısıdır. Böylece, hipoksik embriyonik retinal progenitörlerin hem kurbağa hem de zebra balığı embriyolarının% 5'inin oksijen altında inkübasyonun 1 saat içinde proliferasyonu azalttığını gösterdik.

Hakim olduktan sonra, kurulumumuz, doğrudan in vivo deneyler için, herhangi bir belirli periyot için ve normal, hipoksik veya hiperoksit oksijen konsantrasyonu altında veya herhangi bir diğer verilen gaz karışımında, küçük su ürünleri model organizmaları ile birlikte kullanılmak üzere kullanılabilir.

Introduction

Hypoxia araştırması çok sayıda uygulamaya sahiptir. Bunlar, hipoksi 1 ve akut yüksek rakım hastalığı 2 ile karakterize edilen tıbbi koşullar için patogenezi araştırmak ve tedavileri geliştirmektir. Hipoksik stres, oksijen gerektiren tüm organizmalarda önemli metabolik değişikliklere neden olur. Hipoksik stres ayrıca fetusun büyümesini ve gelişimini ve intrauterin büyüme kısıtlamasını da içeren çeşitli insan hastalıklarının patogenezini etkiler. Hipoksik stres, doğum kilosunun, fetal ve neonatal mortalitenin azalmasına neden olmakla kalmaz, aynı zamanda kardiyovasküler hastalık, tip-2 diyabet, obezite ve hipertansiyon 4 gibi yetişkinlikte birçok komplikasyona neden olabilir. Hipoksik stres, sıklıkla tümörün gelişimi sırasında, tümör dokusu kan dolaşımını zorlaştıracağında da görülür. Bu nedenle , in vivo ve doğrudan embr sırasında hipoksi etkilerini incelemek mümkün önemlidir Yonic gelişme.

Gelişme sırasında hipoksi etkilerini incelemek için kullanılan en iyi bilinen yöntemler arasında, büyüme ortamında kobalt klorür kullanılması veya organizmanın hipoksit bir bölgede kuluçkalanması bulunur. Kobalt klorür, proteozomal bozunmayı önleyerek hipoksi-indüklenebilir faktör-1 alfa (HIF-1α) 'nın stabilizasyonundaki rolü nedeniyle yapay olarak normal oksijen konsantrasyonu altında hipoksik bir tepki uyandırır 5 , 6 , 7 . Bununla birlikte, uygun bir yöntem olan 8 , kobalt klorür ve diğer benzer kimyasal hipoksi mimetiklerinin kullanımı, hücreler ve dokular üzerinde spesifik olmayan zararlı etkilere, örneğin apoptoz 9'a neden olabilir . Dolayısıyla, hipoksik odalar normal gelişim sürecinde canlılardaki "doğal hipoksi" oluşumunda daha iyi bir yöntemdir.

Ntent "> Suda yaşayan hayvan embriyolarında hipoksi teşvik sistemi geliştirmeye odaklandık Hem kurbağalar hem de zebra balığı birçok biyolojik sürecin yanı sıra çeşitli insan hastalıkları modelleri için omurgalı model organizmalar haline geldi Frog ve zebra balığı embriyoları Maternal tazminatın komplikasyonunu ortadan kaldırarak harici olarak gelişir.Ayrıca, hızlı bir gelişim seyri, çevresel faktörleri manipüle etmeyi ve organ oluşumundaki fenotipik değişiklikleri gerçek zamanlı olarak gözlemlemeyi mümkün kılar.Ayrıca, büyük sinyal iletim yollarının birçok bileşeni, Bu model organizmalar ve geniş bir literatür tarafından detaylandırılmışlardır Kurbağalar ve zebra balığı embriyolarının hipoksinin omurgalıların gelişimi üzerindeki etkilerini incelemekteki ana avantajı oksijenin embriyolara çabucak nüfuz etmesi nedeniyle tüm proseslerin doğrudan izlenebilmesidir. Böylece kurbağalar ve zebra balığı gibi, diğer model organizmaların aksineFare embriyolarında, spesifik bir oksijen konsantrasyonunun etkisi, işlevsel vaskülatürün varlığını veya eksikliğini göz önüne almadan, ilgi dokusunda incelenebilir.

Piyasada bulunan hipoksik inkübasyonun çoğu kurulumu, karşılaştırılabilir büyüklükte ve buna bağlı olarak yüksek işletme maliyetlerine sahip olma dezavantajına sahiptir. Yüksek başlangıç ​​maliyeti ve gaz tüketiminin yanı sıra, ortak hipoksi odalarının dengelenmesi ve bakımı, daha büyük boyut ve / veya organizma solunumundan dolayı doğal olarak bu odacıklarda oluşan gaz gradyanına karşı sabit hipoksik atmosferin sürdürülmesini gerektirir. Bu, gaz fanlarının ve soğutma sisteminin kullanılmasını gerektirir; bu soğutma sistemi, gerekli ek donanım miktarını arttırır, araştırmacının becerisini engeller ve genel olarak deneysel prosedürün basitliğini azaltır. Buna karşın, burada sunduğumuz kurulum, karşılaştırılabilir sağlam ancak çok düşük maliyetli, küçük, kurulması kolay ve fAst gazı dengelemesi, dengeli hipoksik atmosfer ve odacık içindeki malzeme ve solüsyonların basit bir şekilde değiş tokuşu. Sistemimiz, herhangi bir suda yaşayan herhangi bir organizma organizmasıyla kullanılmak üzere istihdam edilebilir.

Elverişli olarak küçük olan ve dolayısıyla herhangi bir sıcaklıkta deneysel prosedürlere kolayca izin veren ortak bir laboratuvar inkübatörüne yerleştirilebilen bir hipoksik oda oluşturduk. Ortamda oksijen konsantrasyonunun yanı sıra sıcaklığın uygun bir şekilde kontrol edilmesini sağlayarak, sistemimizin piyasada bulunan hipoksi inkübatörlerine karşı avantajı küçük boyut ve maliyet etkinliğidir. Dolayısıyla, kurulumumuz, araştırma laboratuvarlarının çoğunluğu için mevcut olan genel laboratuar malzemeleri kullanılarak kurulabilir ve pahalı malzemeler gerektirmez. Ek olarak, kurulumumuz piyasada bulunan hipoksi inkübatörlerinin aksine ısı üretmez ve oda sıcaklığının altındaki sıcaklıklarda inkübatöre konulmasını sağlar. LaSt özellikle gelişimsel ve metabolik oranlara sıcaklığa bağlı olan kurbağalar ve balık gibi soğuk kanlı organizmalar ile çalışmak için kritik önem taşır.

Çok düşük maliyetli ve kolayca kurulabilen gaz kuluçka haznemiz, çeşitli hipoksik veya hiperoksik koşulların oluşturulmasında çok yönlüdür ve geniş bir deney koşulları için farklı ortam ve solüsyonların hızlı ve kolay uygulanmasını sağlar. Buna ek olarak, yaygın olarak kullanılan tabaklar veya laboratuvar tankları yerine 10'luk , 11'inci , 12'li olmak üzere 24'lü bir plak kullanan sistemimiz, aynı anda birkaç mutant koşulun gözlemlenmesine ve deneysel olarak işlemesine izin verir.

Doğru hipoksinin indüksiyonunu kontrol etmek için Western blot tespiti ile HIF-1α protein seviyelerini izledik. Buna ek olarak, inkübasyondan önce ve sonra çoğalan hücrelerin sayısıHipoksik odadaki n, dokuda hipoksi oluştuğunu belirlemek için kullanılabilir. Bu yöntem, hipoksi öncesi embriyonik retinal kök hücre nişinde çoğalmanın azaldığını gösteren daha önce yayınlanmış sonuçlarımıza 13 dayanır. Bu nedenle, embriyo ortamına 5-etinil-2'-deoksiuridin (EdU) ekleyerek ve yeni çoğalmakta olan hücrelerin DNA'sına dahil edilmesini ölçerek retinal kök hücre çoğalmasının seviyesini izledik.

Protocol

Bu protokol, Cambridge Üniversitesi hayvan bakım kılavuzlarına uygundur. 1. Hayvan Bakımı Kurbağa embriyoları NOT: Embriyolar hayvan ve laboratuar tesislerine göre yükseltilebilir ve bakımı yapılabilir. Burada, hayvan bakımı örneği açıklanmaktadır. 0.88 mM NaCl, 10 uM KCI, 24 uM NaHC03, 100 uM HEPES, 8.2 uM MgS04, 3.3 uM Ca (NO3) 2 ve 4.1 uM CaCl2, pH 7.6'dan oluşan 0.1x Modifiye Barth's Solution (MBS) çözeltisini hazırlayın….

Representative Results

Burada sunduğumuz hipoksik odacık sisteminin kullanılması, hipoksinin tek tek ve canlı tüm canlı hayvanlar üzerindeki etkilerinin incelenmesine olanak tanır. Hipoksi, tüm kurbağa veya zebra balığı embriyolarını hipoksik bölmeye ( Şekil 1 ) yerleştirerek indükleyebilir ve koşulların farklı kombinasyonları üzerinde üstlenilebilir. Tamamlanmış gaz odası yerleşiminin bir görüntüsü Şekil 2'de</s…

Discussion

Burada, kurbağa ve zebra balığı embriyolarıyla kullanılmak üzere ayarlanmış, ancak diğer su organizmaları için de uygun olan hipoksiyi indüklemek için kolay ama sağlam yeni bir yöntem sunduk. Bu yöntemin en büyük avantajı basitliği ve maliyet etkinliğidir. Bununla birlikte, bu yöntemle elde edilen sonuçlar çok sağlamdır. Hipoksinin odadaki hem tüm embriyolar hem de spesifik doku – burada retinalar – içinde etkili bir şekilde indükte edilebileceğini gösterdik. Hipoksi indüksiyonunun etki…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Wellcome Trust SIA Ödülü 100329 / Z / 12 / Z'den WAH'ya ve DFG bursu KH 376 / 1-1'e Destek ile desteklendi.

Materials

Sodium chloride Sigma S7653 NaCl / 0.1X MBS, Embryo medium, 10X TBST
Potassium chloride Sigma P9333 KCl / 0.1X MBS, Embryo mediu,
Sodium bicarbonate Sigma S5761 NaHCO3 / 0.1X MBS
HEPES Sigma H3375 0.1X MBS
Magnesium sulfate Sigma M7506 MgSO4 / 0.1X MBS, Embryo medium
Calcium nitrate Sigma 202967 Ca (NO3)2 / 0.1X MBS
Calcium chloride Sigma C1016 CaCl2 / 0.1X MBS, Embryo medium
Methylene blue Sigma M9140 Embryo medium
Pregnant mare serum gonadotropin Sigma CG10 frog fertilization
Zebrafish breeding tank Carolina 161937 gas chamber construction
24-well plate Thermo Scientific 142475 Nunclon Delta Surface, for gas chamber construction
Epoxy resin RS Components UK Kit 199-1468
Gas distributor valve WPI Luer Valves Kit 14011 aquatic tank attachment (Schema 1, H)
High precision gas valve BOC  200 bar HiQ C106X/2B gas tank attachment (Schema 1, I)
5% oxygen and 95% N2 gas tank BOC 226686-L hypoxic gas mixture
ceramic disc diffuser CO2 Art  Glass CO2 Nano Aquarium Diffuser, DG005DG005 Schema 1, J
silicone grease Scientific Laboratory Supplies VAC1100 Schema 1, K
oxymeter Oxford Optronix  Oxylite, CP/022/001 hypoxic chamber setup
fibre-optic dissolved oxygen sensor Oxford Optronix HL_BF/OT/E hypoxic chamber setup
plastic pasteur pipette Sterilin STS3855604D for embryo transfer
MS222  Sigma Aldrich E10521-50G embryo anesthetic
RIPA buffer  Sigma R0278-50ML tissue homogenization
Protease inhibitor Sigma P8340 tissue homogenization
Tris Sigma 77-86-1 4X Laemmli loading buffer, 10X TBST
Glycerol Sigma G5516 4X Laemmli loading buffer
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma L3771 SDS, 4X Laemmli loading buffer, 5X Running buffer
beta-Mercaptoethanol  Sigma M6250 4X Laemmli loading buffer
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126 4X Laemmli loading buffer
Trizma base  Sigma 77-86-1 5X Running buffer, Transfer buffer
Glycine Sigma G8898 5X Running buffer, Transfer buffer
Methanol Sigma 34860 Transfer buffer
Tween 20 Sigma P2287-500ML 10X TBST
skim milk powder Sigma 70166 Blocking Solution
Eppendorf microcentrifuge tube Sigma T9661
tissue homogenizer Pellet Pestle Motor Kontes Z359971 tissue homogenization
pellet pestles Sigma Z359947-100EA tissue homogenization
precast 12% gel Biorad Mini-ProteinTGX, 456-1043 Western Blot
protein ladder Amersham Full-Range Rainbow ladder, RPN800E Western Blot
nitrocellulose membrane (0.45 µm) Biorad 162-0115 Western Blot
anti-HIF-1α antibody Abcam ab2185 Western Blot
anti-α-tubulin antibody Sigma T6074 Western Blot
goat anti-rabbit antibody Abcam ab6789 Western Blot
goat anti-mouse antibody Abcam ab97080 Western Blot
Pierce ECL 2 reagent  Thermo Scientific 80196 Western Blot
ECL films Hyperfilm GE Healthcare Amersham 28906837 Western Blot
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine   santa cruz CAS 61135-33-9 EdU, EdU incorporation
Phosphate-buffered Saline Oxoid BR0014G 1X PBS
Formaldehyde Thermo Scientific 28908 Fixation solution
Sucrose Fluka S/8600/60 Solution solution
Triton X-100 Sigma T9284-500ML PBST
Heat-inactivated Goat Serum Sigma G6767-100ml HIGS, Blocking solution (EdU incorporation)
4',6-diamidino-2-phenylindole  ThermoFisher Scientific D1306 DAPI, EdU incorporation
Dimethyl sulfoxide Molecular Probes C10338 DMSO, EdU incorporation
glass vial VWR 98178853 EdU incorporation analysis
Tissue-Plus optimal cutting temperature compound  Scigen 4563 embedding medium, EdU incorporation analysis
cryostat Jung Fridgocut 2800E Leica  CM3035S EdU incorporation analysis
microscope slides Super-Frost plus Menzel glass Thermo Scientific J1800AMNZ EdU incorporation analysis
EdU Click-iT chemistry kit Molecular Probes C10338 EdU incorporation analysis
FluorSave Calbiochem D00170200 mounting medium, EdU incorporation analysis
coverslips VWR ECN631-1575 EdU incorporation analysis
fluorescent microscope Nikon Eclipse 80i EdU incorporation analysis
confocal scanning microscope Olympus Fluoview FV1000 EdU incorporation analysis
Volocity software PerkinElmer Volocity 6.3 EdU incorporation analysis

Referenzen

  1. Grocott, M., Montgomery, H., Vercueil, A. High-altitude physiology and pathophysiology: implications and relevance for intensive care medicine. Crit Care. 11 (1), 203 (2007).
  2. Grant, S., et al. Sea level and acute responses to hypoxia: do they predict physiological responses and acute mountain sickness at altitude?. Brit J Sport Med. 36 (2), 141-146 (2002).
  3. Kajimura, S., Aida, K., Duan, C. Insulin-like growth factor-binding protein-1 (IGFBP-1) mediates hypoxia-induced embryonic growth and developmental retardation. PNAS. 102 (4), 1240-1245 (2005).
  4. Ong, K. K., Dunger, D. B. Perinatal growth failure: the road to obesity, insulin resistance and cardiovascular disease in adults. Best Pact Res Clin Endocrinol Metab. 16, 191-207 (2002).
  5. Maxwell, P., Salnikow, K. HIF-1: an oxygen and metal responsive transcription factor. Cancer Bio Ther. 3 (1), 29-35 (2004).
  6. Semenza, G. L., Roth, P. H., Fang, H. M., Wang, G. L. Transcriptional regulation of genes encoding glycolytic enzymes by hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem. 269 (38), 23757-23763 (1994).
  7. Yuan, Y., Hilliard, G., Ferguson, T., Millhorn, D. E. Cobalt inhibits the interaction between hypoxia-inducible factor-alpha and von Hippel-Lindau protein by direct binding to hypoxia-inducible factor-alpha. J Biol Chem. 278 (18), 15911-15916 (2003).
  8. Elks, P., Renshaw, S. A., Meijer, A. H., Walmsley, S. R., van Eeden, F. J. Exploring the HIFs, buts and maybes of hypoxia signalling in disease: lessons from zebrafish models. Disease Models & Mechanisms. 8, 1349-1360 (2015).
  9. Guo, M., et al. Hypoxia-mimetic agents desferrioxamine and cobalt chloride induce leukemic cell apoptosis through different hypoxia-inducible factor-1alpha independent mechanisms. Apoptosis. 11 (1), 67-77 (2006).
  10. Woods, I. G., Imam, F. B. Transcriptome analysis of severe hypoxic stress during development in zebrafish. Genom Data. 6, 83-88 (2015).
  11. Rouhi, P., et al. Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish. Nat Protoc. 5 (12), 1911-1918 (2010).
  12. Stevenson, T. J., et al. Hypoxia disruption of vertebrate CAN pathfinding through EphrinB2 is rescued by magnesium. PLoS Genet. 8 (4), e1002638 (2012).
  13. Khaliullina, H., Love, N. K., Harris, W. A. Nutrient-Deprived Retinal Progenitors Proliferate in Response to Hypoxia: Interaction of the HIF-1 and mTOR Pathway. J Dev Biol. 4 (2), (2016).
  14. Nieuwkoop, P. D., Faber, J., Nieuwkoop, D. P., Faber, J. . Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1994).
  15. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  16. Kohn, D. F., Wixson, S. K., White, W. J., Benson, G. J. . Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals. , (1997).
  17. McDonough, M. J., et al. Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue. JoVE. (70), (2012).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Khaliullina-Skultety, H., Zi Chao, N., Harris, W. A. Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (124), e55710, doi:10.3791/55710 (2017).

View Video