Summary

ניתוח היסטולוגית של פגיעה חריפה בכבד אלכוהול דג הזברה

Published: May 25, 2017
doi:

Summary

פרוטוקול זה מתאר ניתוח היסטולוגית של הכבד מן הזחלים דג הזברה כי טופלו באתנול 2% עבור 24 שעות. טיפול כזה אתנול חריפה התוצאות סטאטוזיס כבד נפיחות של כלי הדם הכבד.

Abstract

מחלת כבד אלכוהולית (ALD) מתייחסת לנזק לכבד עקב שימוש חריף או חריף באלכוהול. זה בין הגורמים המובילים של תחלואה ותמותה הקשורים אלכוהול, משפיע על יותר מ -2 מיליון אנשים בארצות הברית. הבנה טובה יותר של המנגנונים הסלולר והמולקולריים העומדים מאחורי פגיעה בכבד הנגרמת על ידי אלכוהול היא הכרחית לפיתוח טיפול יעיל ל- ALD. זחלי דג הזברה התערוכה סטאטוזיס כבד ו fibrogenesis רק לאחר 24 שעות של חשיפה לאתנול 2%, מה שהופך אותם שימושי עבור מחקר של פגיעה חריפה בכבד אלכוהול. עבודה זו מתארת ​​את ההליך לטיפול באתנול חריף בזחלי דג הזברה, ומראה כי היא גורמת להתפתחות סטטוזה ונפיחות של כלי הדם הכבד. פרוטוקול מפורט עבור Hematoxylin ו Eosin (H & E) מכתים כי הוא מותאם לניתוח היסטולוגית של כבד הזחל דג הזברה, מתואר גם. מכתים H & E יש יתרונות ייחודיים מסוימים על ידי immunofluorescence, כפי שהוא מסמן את כל החייםתאים er ותאים תאיים בו זמנית והוא יכול בקלות לזהות פגיעה בכבד, כגון סטאטוזיס ו פיברוזיס. לאור השימוש הגובר של דג הזברה בדגימת רעלן הנגיף הנגרמת על ידי וירוס, כמו גם מחלות כבד בירושה, פרוטוקול זה משמש כנקודת התייחסות לניתוח היסטולוגית שבוצעה בכל המחקרים הללו.

Introduction

מחלת כבד אלכוהולית (ALD), הנגרמת על ידי צריכת יתר של אלכוהול, היא הגורם העיקרי לתחלואה ותמותה הקשורים לאלכוהול. בארצות הברית, כמעט מחצית ממקרי המוות של מחלת כבד כרוכים באלכוהול 1 , ו- ALD אחראי על כמעט 1 מתוך 3 השתלות כבד 2 . ALD יש ספקטרום רחב. סטאטוזיס, אשר מאופיין על ידי הצטברות שומנים עודף hepatocytes, מתרחשת בשלב מוקדם של שתייה כבדה והוא הפיך עם הפסקת השימוש באלכוהול. תחת ההשפעה של גורמים גנטיים וסביבתיים צריכת אלכוהול מתמשך, סטאטוזיס כבד יכול להתקדם הפטיטיס אלכוהוליים, ובסופו של דבר, שחמת הכבד 3 . מחקרים באמצעות מודלים מכרסמים ALD סיפקו תובנות משמעותיות למחלה, אבל יש להם מגבלות (נבדק בהתייחסות 3 ). הזנה אוראלית של דיאטה אלכוהול גורם רק סטאטוזיס במכרסמים 4 , </ Sup> 5 . התפתחות של דלקת ו fibrosis דורש גם העלבון השני 6 , 7 או עירוי intragastric כרונית, אשר פולשנית מבחינה טכנית מאתגר 8 , 9 . דג הזברה Telost גם מפתחת פגיעה בכבד בתגובה לטיפול כרוני ו חריף אלכוהול 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 . בפרט, דג הזברה הזחל מייצג אורגניזם מודל משלים מושך שבו ללמוד פגיעה חריפה בכבד אלכוהול 10 , 11 , 13 , 15 . הכבד דג הזברה הוא פונקציונלי מייצר אנזימים מפתח עבור מטבוליזם אתנול על ידי 4 ימיםשל הפריה (dpf) 13 , 16 , 17. אתנול ניתן להוסיף ישירות למים, וחשיפה לאתנול 2% במשך 24 שעות מספיקה כדי לגרום סטאטוז בכבד ותגובות fibrogenic בזחלים דג הזברה 13 , 15 .

זה כבר דווח כי הטיפול עם אתנול 2% במשך 24 שעות הביאה ריכוז אתנול רקמות של 80 מ"מ זחלים דג הזברה 13 . אחרים הראו כי הזחלים לסבול ריכוז זה פנוטיפים הכבד לראות את החיות המטופלים ספציפיים לחשיפה אתנול 11 , 13 , 15 , 18 . עם זאת, בגלל 80 מ"מ הוא כמעט קטלני בבני אדם 19 , חשוב להעריך את היסטולוגיה הכבד של דג הזברה שטופלו אתנול ו deteRmine הרלוונטיות הפיזיולוגית לבני אדם.

התפתחות חיצונית מהירה שקיפות של הזחלים דג הזברה מאפשרים לאפיין את הפעולה של אלכוהול בתוך הכבד בזמן אמת דגימות קבוע. הזמינות של תאים מסוג ספציפי קווי ניאון מהונדס ההתקדמות האחרונות מיקרוסקופיה confocal להקל על המחקר של כמה סוגים שונים של תאים בכבד לשנות את המורפולוגיה שלהם והתנהגות בתגובה לטיפול אתנול חריפה 11 , 15 . עם זאת, הדמיה confocal של דג הזברה מהונדס פלואורסצנטי לא יכול להחליף לחלוטין Hematoxylin ו Eosin (H & E) מכתים בעת לימוד היסטולוגיה הכבד. סימון כל סוגי תאי הכבד באותו זמן באמצעות דג הזברה מהונדס דורש את הדור של קווים מהונדס הפרט, כל תיוג אחד סוג תא הכבד עם fluorophore ייחודי. הצגת רקע מהונדס שונה לתוך אותו דג דורש breedinG דורות מרובים, וזה זמן רב ויקר. מכתים immunofluorescence נוספים יש צורך לזהות רכיבים מטריקס תאיים. H & E מכתים, לעומת זאת, בו זמנית תוויות כל סוגי תאי הכבד ורכיבים מטריקס תאיים, ובכך לספק סקירה של הכבד 20 . יתר על כן, הוא מגלה בקלות כמה תכונות histopathological של מחלות כבד, כגון מוות hepatocyte, סטאטוזיס, ו פיברוזיס. למרות H & E הוא כתם שגרתית היסטולוגיה כבד יונקים, זה לא נפוץ במחקר כבד דג הזברה, והפרוטוקול הוא הקים פחות טוב.

עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול לטיפול אתנול חריפה הזחלים דג הזברה עבור מעקב אחר היסטולוגית עם מכתים H & E מכתים. פרוטוקול H & E מכתים ניתן להשתמש בכל המחקרים של התפתחות הכבד ואת הפונקציה. יתר על כן, חלקים פרפין יכול לשמש אימונוהיסטוכימיה, כמו גם עבור sta מיוחד אחרIn פתולוגיה של הכבד, כולל כתם trichrome, כתם reticulin, וכו ' .

Protocol

AB WT מבוגר הזברה דג הזברה נשמרו בתנאים סטנדרטיים 21 בהתאם מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (מכוני הבריאות הלאומיים פרסום 86-23, מתוקן 1985); השימוש בהם אושר על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש בבית החולים לילדים Cincinnati החולים הרפו…

Representative Results

10% שנאגרו פורמלין ו paraformaldehyde 4% (PFA) הם שניים של fixatives הנפוצים ביותר המשמשים פרקטיקות היסטולוגיה. עם זאת, הם לא נותנים תוצאות קיבעון אופטימלי עבור דג הזברה דג הזברה ( איור 1 ו 1 טבלה ). קיבוע עם פורמולין 10% או 4% PFA לעיתים קרובות התוצ…

Discussion

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הליך מפורט לטיפול אתנול חריף זחלי דג הזברה ואת ניתוחים histopathological שלאחר מכן עם מכתים H & E. טיפול אתנול חריף צריך להתבצע לא לפני 96 שעות לאחר ההפריה, שכן זהו השלב שבו הכבד דג הזברה מתחיל להביע אנזימים מטבוליזם אלכוהול 13 . 2% אתנול הוא המ?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מבקשים להודות לד"ר קייטי מוריי במרכז המשאבים הבינלאומי של דג הזברה; ד"ר סטייסי הופרט וקארי הופרט ב CCHMC, על עצות מועילות שלהם על הפרוטוקול; ו CCHMC שירות וטרינרי, עבור טיפול דגים. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH R00AA020514 ומענק מחקר מהמרכז לגנום ילדים ב CCHMC (ל- CY). זה היה גם תמיכה בחלקו על ידי מענק NIH P30 DK078392 (אינטגרטיבית מורפולוגיה Core) של מרכז העיכול מחקר מרכז הליבה בסינסינטי.

Materials

1.5 mL centrifuge tubes E & K Scientific 280150
15 mL conical tubes VWR International 89039-664
50 mL conical tubes VWR International 89039-658
95% ethanol Decon Labs, Inc. 2801 Flammable
Acetic acid Newcomer Supply 10010A Irritant
Agarose Research Products International 9012-36-6
Aluminum jar rack holder Newcomer Supply 5300JRK
Bacteriological petri dishes with lid Corning 351029
Biopsy pads Simport M476.1
Charged slides Fisher Scientific 12-550-16
Clear mounting media Fisher Scientific 8310-16 Can be substituted with other clear mounting media
Commercial sea salts Instant Ocean SS15-10
Disposable microtome blades Fisher Scientific 4280L
Dissecting microscope Leica Biosystems Leica Mz 95
Enclosed tissue processor Leica Biosystems ASP300 S
Eosin-Phloxine stain set Newcomer Supply 1082A
Ethyl alcohol Sigma-Aldrich E7023 Flammable
Formaldehyde solution, ACS reagent, 37 WT. % in H20, contains 10-15% methanol as stabilizer (to prevent polymerization) Sigma-Aldrich 252549 A suspected carcinogen; irritant
Formalin, Buffered, 10% Fisher Scientific SF100-4 A suspected carcinogen; irritant
Graduated media bottle VWR International 16159-520
Harris hematoxylin Poly Scientific R&D Corp. s212 Irritant
Histology molds Sakura Finetek USA Inc 4557
Hot plate/Stirrer VWR International 47751-148
Hydrochloric acid Fisher Scientific A144 Irritant
Incubator VWR International 97058-220
Insulin syringes BD Medical BD-309301
Inverted compound microscope Carl Zeiss Microscopy 491912-9850-000
Isopropanol Newcomer Supply 12094E Flammable
Methylene blue Sigma-Aldrich M9140 Irritant
Microtome Leica Biosystems Leica Jung BioCut 2035 
Nutating mixer VWR International 82007-202
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148-1KG A suspected carcinogen; irritant
Pasteur pipet VWR International 53283-916
Pipette pump (10 mL) VWR International 53502-233
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791
Razor blades Grainger 4A807
Slide Staining Kit Newcomer Supply 5300KIT
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S3014
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher BioReagents S318-500 Very hazardous
Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) Sigma-Aldrich S3264
Stainless steel strainer (5 inch diameter) Adaptive Science Tools L0906045in
Tissue cassettes Simport M505.12
Tissue embedding center Sakura Finetek USA Inc #5100
Tissue wipers, 1-Ply Fisher Scientific 06666A
Transfer pipets Fisher Scientific 137117M
Tricaine powder/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt Sigma-Aldrich A5040 Irritant
Tris base, primary standard and buffer Sigma-Aldrich T1503
Wash bottle, low-density polyethylene, wide mouth Nalge Nunc International 2402-0750
Xylenes Fisher Scientific X3S-4 Irritant

Referenzen

  1. Yoon, Y. H., Chen, C. M., Yi, H. Y. . Surveillance report #100: Liver cirrhosis mortality in the United States: National, State, and regional trends. , 2000-2011 (2014).
  2. Singal, A. K., et al. Evolving frequency and outcomes of liver transplantation based on etiology of liver disease. Transplantation. 95 (5), 755-760 (2013).
  3. Louvet, A., Mathurin, P. Alcoholic liver disease: mechanisms of injury and targeted treatment. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 12 (4), 231-242 (2015).
  4. Ki, S. H., et al. Interleukin-22 treatment ameliorates alcoholic liver injury in a murine model of chronic-binge ethanol feeding: role of signal transducer and activator of transcription 3. Hepatology. 52 (4), 1291-1300 (2010).
  5. Tsuchiya, M., et al. Interstrain differences in liver injury and one-carbon metabolism in alcohol-fed mice. Hepatology. 56 (1), 130-139 (2012).
  6. Koteish, A., Yang, S., Lin, H., Huang, X., Diehl, A. M. Chronic ethanol exposure potentiates lipopolysaccharide liver injury despite inhibiting Jun N-terminal kinase and caspase 3 activation. J Biol Chem. 277 (15), 13037-13044 (2002).
  7. Leo, M. A., Lieber, C. S. Hepatic fibrosis after long-term administration of ethanol and moderate vitamin A supplementation in the rat. Hepatology. 3 (1), 1-11 (1983).
  8. Tsukamoto, H., et al. Severe and progressive steatosis and focal necrosis in rat liver induced by continuous intragastric infusion of ethanol and low fat diet. Hepatology. 5 (2), 224-232 (1985).
  9. Tsukamoto, H., Mkrtchyan, H., Dynnyk, A. Intragastric ethanol infusion model in rodents. Methods Mol Biol. 447, 33-48 (2008).
  10. Howarth, D. L., Passeri, M., Sadler, K. C. Drinks like a fish: using zebrafish to understand alcoholic liver disease. Alcohol Clin Exp Res. 35 (5), 826-829 (2011).
  11. Howarth, D. L., Yin, C., Yeh, K., Sadler, K. C. Defining hepatic dysfunction parameters in two models of fatty liver disease in zebrafish larvae. Zebrafish. 10 (2), 199-210 (2013).
  12. Lin, J. N., et al. Development of an Animal Model for Alcoholic Liver Disease in Zebrafish. Zebrafish. , (2015).
  13. Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).
  14. Tsedensodnom, O., Vacaru, A. M., Howarth, D. L., Yin, C., Sadler, K. C. Ethanol metabolism and oxidative stress are required for unfolded protein response activation and steatosis in zebrafish with alcoholic liver disease. Dis Model Mech. 6 (5), 1213-1226 (2013).
  15. Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. The bHLH transcription factor Hand2 marks hepatic stellate cells in zebrafish: Analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. , (2012).
  16. Lassen, N., et al. Molecular cloning, baculovirus expression, and tissue distribution of the zebrafish aldehyde dehydrogenase 2. Drug Metab Dispos. 33 (5), 649-656 (2005).
  17. Reimers, M. J., Hahn, M. E., Tanguay, R. L. Two zebrafish alcohol dehydrogenases share common ancestry with mammalian class I, II, IV, and V alcohol dehydrogenase genes but have distinct functional characteristics. J Biol Chem. 279 (37), 38303-38312 (2004).
  18. Zhang, C., Ellis, J. L., Yin, C. Inhibition of vascular endothelial growth factor signaling facilitates liver repair from acute ethanol-induced injury in zebrafish. Dis Model Mech. , (2016).
  19. Vonghia, L., et al. Acute alcohol intoxication. Eur J Intern Med. 19 (8), 561-567 (2008).
  20. Wittekind, D. Traditional staining for routine diagnostic pathology including the role of tannic acid. 1. Value and limitations of the hematoxylin-eosin stain. Biotech Histochem. 78 (5), 261-270 (2003).
  21. Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2007).
  22. Theise, N. D. Histopathology of alcoholic liver disease. Clinical Liver Disease. 2 (2), (2013).
  23. Lorent, K., et al. Inhibition of Jagged-mediated Notch signaling disrupts zebrafish biliary development and generates multi-organ defects compatible with an Alagille syndrome phenocopy. Development. 131 (22), 5753-5766 (2004).
  24. Huang, M., Xu, J., Shin, C. H. Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration. J Vis Exp. (111), (2016).
  25. Paredes, J. F., Lopez-Olmeda, J. F., Martinez, F. J., Sanchez-Vazquez, F. J. Daily rhythms of lipid metabolic gene expression in zebra fish liver: Response to light/dark and feeding cycles. Chronobiol Int. 32 (10), 1438-1448 (2015).
  26. Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43 (5), 610-614 (2007).
  27. van der Velden, Y. U., et al. The serine-threonine kinase LKB1 is essential for survival under energetic stress in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (11), 4358-4363 (2011).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Ellis, J. L., Yin, C. Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish. J. Vis. Exp. (123), e55630, doi:10.3791/55630 (2017).

View Video