Her presenterer vi en prosedyre for å utføre storskala Ca 2+ avbildning med cellulær oppløsning på tvers av flere kortikale lag i fritt bevegelige mus. Hundrevis av aktive celler kan observeres samtidig ved hjelp av et miniatyrhodet mikroskop kombinert med en implantert prisme sonde.
In vivo krets og mobilnivå funksjonell bildebehandling er et kritisk verktøy for å forstå hjernen i handling. Høyoppløselig bildebehandling av musekortiske nevroner med tofotonmikroskopi har gitt unikt innblikk i kortikal struktur, funksjon og plastisitet. Disse studiene er imidlertid begrenset til hodede faste dyr, og reduserer den adferdsmessige kompleksiteten som er tilgjengelig for studier. I dette papiret beskriver vi en prosedyre for å utføre kronisk fluorescensmikroskopi med cellulær oppløsning på tvers av flere kortikale lag i fritt oppførte mus. Vi brukte et integrert miniatyrisert fluorescensmikroskop parret med en implantert prisme sonde for samtidig å visualisere og registrere kalsiumdynamikken til hundrevis av nevroner på tvers av flere lag av den somatosensoriske cortexen som musen forlovet i en romanobservasjonsoppgave i flere dager. Denne teknikken kan tilpasses andre hjernegrupper i forskjellige dyrearter for andre betegnelser paradigms.
Cortexen er en viktig spiller i mange komplekse mentale og atferdsfunksjoner, fra oppmerksomhet, sensorisk oppfatning og top-down kognitiv kontroll 1 , 2 , 3 til motivasjons-, belønnings- og avhengighetsveier 4 , 5 . Å forstå de beregningsmessige prosessene som ligger til grund for sin funksjon er et viktig mål å drive en bedre klinisk forståelse av mange psykiske og atferdsforstyrrelser.
Mange nåværende teorier om psykiatrisk sykdom senterer ideen om at kortikale nevrale krets dysfunksjon eller diskoordinering kan ligge til grund for kognitive og adferdsmessige abnormiteter som er kjennetegn ved forhold som skizofreni 6 , autisme 7 eller tvangssyndrom 8 . Dermed oppnår man nevraaktivitetsdata fra populasjonsnivå fra koRtiske kretser innenfor riktig sammenheng med samtidig atferdsdata er av stor betydning, og kan ideelt sett målrettes mot bestemte celletyper for finere nevrale kretsdiseksjon.
Miniaturiserte mikroskoper i forbindelse med implanterbare gradientbrytningsindeks (GRIN) mikrolinser muliggjør optisk tilgang til neuronale ensembler under frie bevegelige forhold fra et mangfold av mulige hjernegrupper 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , inkludert cortex 14 , 15 , 16 . Ved å bruke et mobilt mikroskopisystem kombinert med genetisk kodede kalsiumindikatorer, muliggjør konsistent avbildning av den samme cellulære befolkningen som omfatter hundrevis av nevroner i løpet av dager til uker i mange hjernegrupper 9 , og kan væreGenetisk målrettet mot bestemte celletyper ved bruk av viral vektor eller transgene teknikker.
Som cortex er kjent for å støtte forskjellige funksjoner og koble til forskjellige hjerneområder, avhengig av plasseringen av cellene i cortical lamina 17 , 18 , 19 , er vi interessert i å skaffe samtidig flerlags nevral aktivitet i våte oppførende fag. Her viser vi hvordan du kan vise hundrevis av fluorescensmerkede nevroner i fritt oppførsel av mus over dager, ved hjelp av det miniatyriserte fluorescensmikroskop 20 parret med en implantert prisme-sonde, som gir en flerlagsvisning av cortexen ( figur 1 ).
Prismåleren som brukes her består av to separate GRIN-linser: et prisme og et sylindrisk reléobjektiv ( figur 1 ). Lyset fra mikroskopet stimulerer fluorescensmerketCeller som befinner seg langs bildebehandlingsoverflaten av prisme-sonden, etter å være reflektert av hypotenus av prismedelen av sonden. Det utstrålede lyset fra cellene reflekterer også av prismens hypotenuse, samles inn gjennom mikroskopens mål og når sensoren i mikroskopet. Prisme sonden som brukes i denne prosedyren er tilpasset for enkel bruk med standard stereotaksisk utstyr.
Det miniatyriserte fluorescensmikroskop 20 detekterer virkningspotensial-fremkalte Ca 2+ transienter i nevronpopulasjoner med enkeltcelleoppløsning, etter at disse cellene har blitt spesifikt merket med Ca 2+ -følsomme genetisk kodede fluorescerende indikatorer. I denne protokollen injiserer vi Ca 2+ -indikatoren kodet i en viral vektor (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40), implanterer en prisme sonde, installerer mikroskopet, og oppnår så mange dager somatosensoriske (S1 bakre lemmer) nevrale aktivitetsdata Fra et dyr avsløreD til nye objektoverflater under fri leting ( figur 2 ).
Forståelse av neural kretsaktivitet under våken oppførsel er et viktig nivå av nevro-vitenskapelig etterforskning som trengs for å effektivt dissekere hjernens funksjon i helse og sykdom. Cortex er en spesielt viktig region for å studere i sammenheng med våken oppførsel, da den spiller en viktig rolle i mange viktige sensoriske, kognitive og utøvende funksjoner 28 , 29 .
Den kortikale kolonnen antas å være den grunnleggende funksjonelle enheten i cortex og populasjonsnivåaktiviteten av kortikale celler er kjent for å variere basert på deres fysiske plassering i kolonnen. Eksempelvis stimulerer eksitatoriske nevroner i lag 2/3 i den somatosensoriske cortex primært til andre neokortiske områder og modulerer andre kortikale nettverk 30 , mens celler i dypere lag primært prosjekterer til subkortiske områder som thalamus 31 . Registrere aktiviteten til hundreS av forhåndsdefinerte corticale celler samtidig og pålitelig over tid på tvers av forskjellige laminer i fritt oppførte fag, vil i stor grad fremme vår forståelse av kortikal informasjonsflyt, noe som muliggjør finere funksjonell disseksjon av kortikale kolonner informert av sanntidsadferddsinformasjon og oppgaverelevant tids- skalaer.
Innsamling av dette nivået av nevrale kretsdata gjøres mulig ved bruk av en effektiv og strømlinjeformet miniatyrisert mikroskopi-plattform for å gjennomføre storskala Ca 2+ -bildebehandling i fritt oppførte fag (eller hovede fag som ønsket). Brukes med genetisk kodede kalsiumindikatorer for å muliggjøre spesifikk målretting av celletype og avbildning av et flerlags synsfelt levert av en kronisk implantert prisme-sonde, undersøkte denne protokollen en sak blant mange mulige anvendelser: observere laminære forskjeller i somatosensorisk kortisk behandling når mus Fysisk engasjert med et nytt objekt ( figur 5 ).Dette er den første prosessuelle illustrasjonen av denne typen spesifikke, in vivo tilnærming for celletype for å studere flere kortikale lag i våte, fritt oppførte dyr, og bredere spekteret av eksperimentelle metoder som er tilgjengelige for å forstå laminære strukturer i den aktive hjerne.
Det periskopiske synsfelt aktivert av prisme-sonden i denne teknikken kan gjennomførbart påføres andre hjernestrukturer når bevaring av vevet direkte dorsalt til en region av interesse er ønsket; For eksempel kan CA3-bildebehandling oppnås uten forstyrrelse av hippokampfunksjonen.
Prismodellbasert tilnærming for avbildning av Ca 2+ -aktivitet krever fysisk innsetting og permanent implantering av en mikroprism i barken, noe som tilsvarer opprettelsen av en kortisk lesjon hvor linsesonden sitter inn. Dette kan føre til forstyrrelser i det lokale nevrale kretsløpet, inkludert avskjæring av apikale dendriter og prosesser. THans prosedyre vil også føre til en initial aktivering av glialceller i regionen, selv om dette forventes å være lokalisert til vevet ca. 150 μm fra prismeflaten, og å avta etter at hjernen har helbredet 22 . Det er svært viktig å vurdere om denne teknikken vil påvirke normal kretsanatomi og / eller oppførsel av dyrene når du planlegger eksperimenter. Behaviorskontrollgrupper bør alltid utføres for å sikre at det ikke er noen signifikante endringer i baseline atferd som kan forårsake forvirrende eksperimentelle resultater.
Ved hjelp av denne miniatyriserte, mobile Ca 2+ -bildebehandlingsteknikken med nevro-farmakologisk manipulasjon, ulike kognitive, sosiale, motoriske eller iboende atferdsparadigmaer, og kombinere det med andre fysiologiske beregninger, kan du fordyre og berike studier som er fokusert på å forstå funksjonelle roller i nevrale kretser i atferd og signal Prosessering 32 . Suppression eller aktivAtion av visse veier modulert av legemidler kan påvirke tilhørende atferd, noe som lett kan studeres ved hjelp av denne teknologien 33 . Forgrening i forskjellige celletyper ved å modifisere målingen av kalsiumindikatoren er en annen kraftig og nyttig applikasjon, og muliggjør mange kreative kombinasjoner av eksperimentelle verktøy for å adressere ulike neurale kretsspørsmål.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gjerne takke V. Jayaraman, DS Kim, LL Looger og K. Svoboda fra Genie-prosjektet Genetisk kodet Neuronal Indicator and Effector (GENIE) på Janelia Research Campus i Howard Hughes Medical Institute for deres sjenerøse donasjon av AAV1-GCaMP6f Til University of Pennsylvania Vector Core. De vil også gjerne takke A. Olson og Neuroscience Microscopy Core ved Stanford University støttet av NIH NS069375 stipend for sine konfokale mikroskopi tjenester.
Neurostar Motorized Ultra Precise Small Animal Stereotaxic Instrument |
Kopf | Model 963SD | Surgery |
Stereoscope | Labomed | Prima DNT | Surgery and Imaging |
Mini Rectal Thermistor Probe (.062"/1.6mm diameter) – 1/4" Jack | FHC | 40-90-5D-02 | Surgery |
Heating Pad 5 X 12.5cm | FHC | 40-90-2-07 | Surgery |
DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | Surgery |
Microsyringe Pump | World Precision Instruments | UMP3 model; serial 155788 F110 | Surgery |
NanoFil 10μL Syringe | World Precision Instruments | NANOFIL | Surgery |
35 G Beveled Tip Nanofil NDL 2PK | World Precision Instruments | NF35BV-2 | Surgery |
Omnidrill35, 115-230V | World Precision Instruments | 503598 | Surgery |
Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19007-05 | Surgery |
nVista | Inscopix | 100-001048 | Imaging |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40 | Penn Vector Core | AV-1-PV3435 | Surgery |
Ketoprofen | Victor Medical | 5487 | Surgery |
Carprofen | Victor Medical | 1699008 | Surgery |
Isoflurane | Victor Medical | 1001054 | Surgery |
Gelfoam (Patterson Veterinary Supply Inc Gelfoam Sponge 12cmx7mm) | Pfizer (Fisher Scientific) | NC9841478 | Surgery |
Dumont #5/45 forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | Surgery |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Surgery |
Dissecting knives | Fine Science Tools | 10055-12 | Surgery |
ProView Implant Kit | Inscopix | 100-000756 | Surgery and Imaging |
ProView Prism Probe 1.0mm-Dia. ~4.3mm Length | Inscopix | 100-000592 | Surgery and Imaging |
Kwik-Sil adhesive pack of 2 | World Precision Instruments | KWIK-SIL | Surgery |
Kwik-Cast Sealant | World Precision Instruments | KWIK-CAST | Surgery and Imaging |
Miniature Optical Mounting Post | Newport | M-TSP-3 | Imaging |
Microscope Baseplate | Inscopix | BPL-2 | Imaging |
Microscope Baseplate Cover | Inscopix | BPC-2 | Imaging |