Multi-couche Cortical Ca²⁺ Imagerie dans les souris à mouvement libre avec des sondes prisme et microscopie à fluorescence miniaturisée

Les procédures impliquant des sujets d'animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel pour les soins et l'utilisation des animaux (IACUC) chez LifeSource Biomedical Services, NASA Ames Research Center, Californie. 1. Préparation pré-opératoire Stériliser les outils à utiliser dans les procédures chirurgicales dans un stérilisateur à perles chaudes et essuyer la zone chirurgicale avec 70% d'éthanol. Allumez le coussin chauffant placé sur le stade stéréotaxique et maintenez-le à 37 ° C. Anesthésier l'animal à l'aide d'isoflurane (5% pour l'induction et 1-2% pour l'entretien, 0,6-0,8 L / min O 2 ). Vérifiez l'absence d'un réflexe de pincement pour évaluer la profondeur de l'anesthésie. Monter l'animal dans un cadre stéréotaxique équipé d'oreille et de barres dentées. Appliquer une pommade ophtalmique sur les yeux de l'animal et les couvrir d'un morceau de papier noir pour les protéger du séchage et des lampes chirurgicales intenses. Injecter par voie sous-cutanée l'animal avec du kétoprofène (2,5Mg / kg) ou carprofène (2,5 mg / kg) 2. Chirurgie par injection de virus Garnir et raser le cuir chevelu entre les yeux et les oreilles et désinfecter la peau avec 3 écouvillons de 70% d'éthanol et de betadine. Exposez le crâne en faisant une incision dans le cuir chevelu, en commençant entre les yeux et en étendant 1,5 cm rostrocaudal avec une lame chirurgicale stérile. Ouvrez la peau pour exposer le crâne et retirez le périoste autour du site d'injection souhaité à l'aide de coton-tige et d'un scalpel. Rincer le crâne avec du PBS stérile. Nettoyez et polissez le crâne avec des écouvillons en coton. Nivelez le crâne et, avec un marqueur, marquez les coordonnées stéréotaxiques pour l'injection de virus. En utilisant une bavure de 0,5 mm sur un microdrillage à grande vitesse (réglé à environ 7 000 à 10 000 tr / min), créez un petit trou dans le crâne. Appliquer une légère pression pendant le forage et nettoyer de manière intermittente la poussière de l'os et humidifier la zone avec du PBS stérile pour éviter que le tissu cérébral ne se surchauffe, jusqu'à ce que la surface du cerveau soit réactiveA fait mal. Gardez le cerveau humide où le trou est foré. Utilisez une aiguille 26 G pour récupérer le virus ( p. Ex . AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40) dans la micro-jeringe, puis remplacez-la par une aiguille 35 G pour injection. Fixez la microseringue chargée de virus au bras manipulateur de l'appareil stéréotaxique. Apportez la seringue à proximité du trou du site d'injection et ajustez l'angle de l'aiguille afin qu'elle pénètre à un angle de 90 ° par rapport à la surface du cerveau. Abaissez l'aiguille jusqu'à ce qu'elle touche la pia-mère et perfore la dure. Commencer à abaisser l'aiguille par incréments de 10 μm / s jusqu'à ce qu'il atteigne la profondeur souhaitée (z). Fixez l'emplacement de l'aiguille là-bas en utilisant le bras stéréotaxique. Réglez la pompe à micro-jeringes pour injecter 250 nL de virus à 25 nL / min. Étape critique: Étant donné que le volume du virus à injecter dépend du titre et de la dilution, exécutez les expériences de dilution au préalable, afin d'établir des critères optimaux de volume et de concentration pour les cellules d'imagerieDans l'expérience. Si un virus survient hors du site d'injection, mettez en pause l'injection et attendez jusqu'à ce que le tissu cérébral absorbe la chute du virus. Attendez 5-7 minutes après que le volume total a été injecté avant de rétracter l'aiguille. Des colorants tels que du vert rapide pourraient également être ajoutés à la solution de virus pour aider à contrôler la vitesse d'injection dans le cas où le virus est vu exsuder hors de la surface du cerveau. Pour l'étiquetage de plusieurs couches dans le cortex, utilisez des injections multiples si nécessaire. Commencez par le premier site ventral, attendez 5-7 minutes après l'injection et tirez l'aiguille vers le point dorsal le plus proche pour injection ( p. Ex., Injectez-le à -1,0 mm AP, 1,5 mm ± ML et 400 et 600 μm DV). Attendez 10 minutes après l'injection finale avant de retirer l'aiguille et de l'enlever de la configuration stéréotaxique. Mélanger une petite quantité d'un adhésif élastomère transparent biocompatible in vivo à partir de la seringue à double cylindre (Par exemple Kwik-Sil) et couvrir le trou dans le crâne avec lui. Appliquer un adhésif de cyanoacrylate sur la couche d'adhésif élastomère et le laisser durcir. Suture le cuir chevelu et permet à l'animal de se remettre de l'anesthésie dans une cage de récupération chaude jusqu'à ce qu'il soit ambulatoire. Administrer le kétoprofène (2,5 mg / kg) ou le carprofène (2,5 mg / kg) par voie sous-cutanée avant de retourner l'animal dans sa cage à domicile. Les sujets de post-chirurgie d'une maison individuelle pour protéger le site de la chirurgie et répéter la dose 24 heures plus tard. Après avoir retiré la micro-jambage, rincer les aiguilles 26 G et 35 G 7 à 10 fois avec de l'eau distillée pour le nettoyer avant le stockage. 3. Prism Probe Implant Surgery 1-2 semaines après l'injection de virus, préparez-vous à la chirurgie d'implant de sonde de prisme. Désinfectez la sonde de prisme dans de l'éthanol à 70% et nettoyez-la avec du papier à lentilles. Insérez la sonde de prisme dans l'outil porte-objectif et serrez la vis hexagonale avec le tournevis. Assied le microscope dans le support de base (leLes aimants le maintiendront en place). Préparez l'animal tel qu'indiqué dans la section Préparation opérationnelle. Garnir et raser la tête de l'animal entre les yeux et les oreilles et désinfecter la peau avec des écouvillons alternatifs d'éthanol et de betadine à 70%. Exposez le crâne en incitant la peau avec une paire de ciseaux stériles et enlevez le volet de la peau et le périoste sous-jacent. Sécher et polir le crâne avec des écouvillons en coton. Assurer une élimination adéquate du tissu musculaire environnant pour créer une base osseuse propre, sèche et large pour la préparation des étapes suivantes. Implant les vis du crâne dans l'hémisphère contralatéral pour rendre l'implant stable et sécurisé. Ceux-ci peuvent également être utiles si vous choisissez d'implanter une barre de tête pour la fixation de la tête réveillée pour préparer l'animal pour les sessions expérimentales d'imagerie à la section 5. Nivelez le crâne et, avec un marqueur marquez les coordonnées AP et ML pour l'insertion des lentilles. L'utilisation d'une bavure de 0,5 mm sur une microdrille ouvre une craniotomie ronde, assurantLe diamètre de la craniotomie est juste supérieur au diamètre du prisme, c'est-à-dire 1,0 mm dans ce cas. Percer doucement tout en s'arrêtant de manière intermittente pour rincer le crâne avec un PBS stérile et l'aspirer avec des cotons à coton. Retirez la poussière d'os qui est générée. Étape critique: placer la craniotomie de telle sorte que lorsque le prisme est inséré dans le cortex, son bord plat (surface d'imagerie) est confronté au site d'injection de virus et se situe dans un rayon de 150 à 200 μm. Arrêtez le forage juste avant que le crâne ne soit complètement dilué. Les vaisseaux sanguins doivent être visibles à travers l'os dilué. Enlevez délicatement la fiche osseuse avec une fine pince à 45 °. Retirez la dureté avec des pince # 5. Étape critique: une fois que le tissu cérébral est exposé, gardez toujours le tissu humide. Placez un coton-tige trempé dans une solution saline stérile sur la craniotomie. Cela maintiendra également la pression sur le tissu. Pour atténuer la pression dans le tissu cérébral duInsertion de l'anneau de la sonde de prisme, crée un tracé d'insertion à l'avance. Fixez un couteau à dissection à bord droit sur le bras du porte-électrode de l'appareil stéréotaxique et montez-le sur l'appareil stéréotaxique dans un angle tel que la lame du couteau est perpendiculaire à la courbure du crâne (angle de 10 ° dans ce cas) et dans un Plan parallèle à la colonne d'injection de virus. Positionnez soigneusement le couteau au-dessus de la craniotomie le long de son bord médian antérieur dans ce cas et ~ 200 μm latéralement par rapport au site d'injection du virus avec la arête de coupe orientée vers l'arrière ( figure 1 ). Éteignez zéro l'axe Z lorsque la pointe du couteau touche la pia et abaissez-la progressivement (par incréments de 10 μm / s) jusqu'à une profondeur à laquelle la sonde de prisme sera insérée. Ensuite, déplacez le couteau 1 mm vers l'arrière pour créer un chemin pour l'avant-garde du prisme. Pause et contrôlez tout saignement qui pourrait se produire lors de l'incision avec un morceau de gelfoam imprégné de solution saline. <li> Une fois que le couteau est dans cette position, rincer le site avec une solution salée stérile et attendre que tout saignement diminue. Ensuite, retirez lentement le couteau à l'aide du micromanipulateur du bras stéréotaxique par incréments de 10 μm / s et placez un morceau d'éponge gelfoam trempé dans une solution saline stérile sur l'incision. Fixez le porte-objectif (avec la sonde de prisme et le microscope) au bras manipulateur stéréotaxique dans le même angle que le couteau à l'étape précédente. Alignez le prisme de sorte que le côté plat du prisme soit au-dessus de l'incision et parallèle à la colonne d'injection de virus. Cette étape pourrait nécessiter une correction fine de la position du bras stéréotaxique. Ajustez l'alignement en restant près du crâne pour obtenir des résultats plus rapides. Une fois que le prisme est à l'angle correct, abaissez-le progressivement dans le cerveau dans des incréments de 10 μm jusqu'à un z final de 1,1 mm pour cette sonde, à partir de la surface du cerveau. Le tissu cérébral s'étendra autour du prisme et toute pression qui est créée est derrière la visualisationSur l'avion et n'affectera pas le champ de vision. Branchez le microscope sur un ordinateur avec un logiciel d'acquisition installé via un port USB3 et visualisez la fluorescence du champ en allumant la LED. Couvrir tout tissu exposé autour du prisme dans la craniotomie dans une couche protectrice très mince d'adhésif élastomère à l'aide d'une aiguille 25G. Une fois que l'adhésif élastomère est durci (habituellement en ~ 3-5 min), utilisez une aiguille de 25G pour appliquer un adhésif de cyanoacrylate pour attacher le verre de la lentille de prisme au crâne adjacent sur la couche d'adhésif élastomère, pour empêcher l'objectif de se déplacer à l'intérieur La craniotomie. Incluez les bords de la manchette de la prisme pour une meilleure adhérence. Ne pas obtenir d'adhésif sur la face supérieure de la sonde de prisme implantée. Une fois que l'adhésif cyanoacrylate est durci, dévisser le porte-objectif et retirer soigneusement le microscope. Ensuite, retirez lentement le bras du manipulateur stéréotaxique pour laisser la sonde de prisme solidement implantée. Appliquer une couche d'acrylique dentaire ouAdhésif de cyanoacrylate autour de l'implant pour couvrir toute la surface du crâne exposée, jusqu'à la toucher du tissu musculaire rétracté environnant. Couvrir une grande zone de crâne avec ce capuchon crânien aidera plus tard à la fixation de la plaque de base. La peau autour du site de l'implant devrait se guérir seul autour du capuchon crânien. Étape critique: ne laissez pas l'adhésif toucher la peau ou le tissu musculaire environnant, et ne pas engloutir aucune peau dans le capuchon crânien. Cela pourrait irriter la peau et entraîner des rayures excessives et des dommages potentiels à l'implant. Facultatif: si vous désirez utiliser une configuration de tête réveillée pour attacher et détacher le microscope à la plaque de base d'un animal dans des séances expérimentales d'imagerie plutôt que d'anesthésier ou de calmer rapidement l'animal, implanter une barre de têtes dans le capuchon crânien compatible avec une tête éveillée, Installation fixe de choix (non démontrée dans ce protocole). Mélanger le catalyseur et la base à partir d'un siliciumSeringue adhésive et déposer une goutte d'élastomère à l'intérieur de la manchette de la prisme pour couvrir le sommet de la lentille de la sonde afin d'éviter toute détérioration et toute poussière lors du décantation. Retirer l'animal du cadre stéréotaxique et permettre une récupération de l'anesthésie dans une chambre chaude. Administrer le kétoprofène (2,5 mg / kg) ou le carprofène (2,5 mg / kg) par voie sous-cutanée et renvoyer l'animal dans une cage de maison propre une fois qu'il est ambulatoire. Dominez tous les sujets pour protéger l'implant et répétez la dose 24 h plus tard. 4. Fixation de la plaque de base pour l'installation du microscope miniature Une semaine à 10 jours après l'implantation de la sonde de prisme, vérifier l'expression du virus dans le tissu à travers la sonde de prisme implantée et attacher une plaque de base sur le crâne si la préparation montre l'activité cellulaire. Le microscope s'appuiera sur la plaque de base pendant l'imagerie en direct. Suivez les étapes décrites dans la procédure préopératoire pour la préparation de l'animal pour la fixation de la plaque de base. Retirez le capuchon adhésif en silicone sur la surface du dessus de lentille de sonde de prisme implanté. Examinez la surface de la sonde de l'objectif et nettoyez doucement les débris avec du papier à lentilles et de l'éthanol à 70% pour que la surface d'imagerie soit propre. Branchez le microscope sur sa boîte DAQ et connectez-le via le port USB3 au PC. Ouvrez le logiciel d'acquisition sur l'ordinateur et connectez le microscope via le port USB3. Utilisez le logiciel d'acquisition pour vérifier l'activité neurale et pour mesurer et documenter les paramètres de champ de vision pour les enregistrements futurs sur ce sujet. Fixez une plaque de base au microscope et fixez la vis de fixation de la plaque de base pour maintenir la plaque de base en position et fixez le microscope dans la pince au microscope sur le bras micromanipulateur stéréotaxique par le corps du microscope. Fixez la pince à une tige Newport, qui peut être montée sur le bras micromanipulateur stéréotaxique. Positionner le microscope au-dessus de la lentille de la prisme à l'aide de la sBras de micromaniputeur tereotaxique. Inspectez visuellement l'orientation en regardant la lentille de prisme du côté et de l'arrière du stade animal. Les axes optiques de l'objectif du microscope et de la sonde du prisme doivent être alignés. Allumez la LED du microscope via le logiciel. Évaluez la qualité de l'alignement du microscope en mettant l'accent sur la face supérieure de la sonde de prisme implantée dans le logiciel d'acquisition. Lorsqu'il est correctement aligné, les bords de la face supérieure de la lentille de la sonde de prisme doivent être tranchants. Ajustez la distance physique du microscope au-dessus de la sonde de prisme implantée à l'aide du bras manipulateur stéréotaxique pour obtenir le plan focal souhaité à l'intérieur du tissu. La distance optiquement optimisée entre l'objectif microscope et la lentille GRIN implantée est de ~ 500 μm. Enregistrez une image de fluorescence de référence une fois que le plan d'imagerie souhaité est capturé. Point critique: à partir de ce point, ne pas ajuster la position du microscope, car cela changera la positionSur le plan d'imagerie dans le tissu. REMARQUE: appliquer de l'adhésif dans l'étape suivante pour réparer en permanence la position de la plaque de base par rapport au capuchon cranial. L'adhésif peut subir un rétrécissement du volume au lendemain ou deux jours, ce qui peut changer le plan focal dans le tissu. Prévenez-le pour cela en mesurant la quantité de retrait pour votre mélange d'adhésif et la distance ex vivo , puis en soutenant la position Z finale du microscope + plaque de base par cette quantité avant de progresser à l'étape d'application de l'adhésif. Utilisez un acrylique dentaire ou un cyanoacrylate pour attacher de façon permanente la plaque de base au capuchon acrylique qui recouvre le crâne de l'animal, reliant l'espace avec l'acrylique ou l'adhésif. L'application de l'acrylique dentaire / cyanoacrylate progressivement et le durcissement en plusieurs étapes peuvent minimiser l'effet du retrait mentionné précédemment sur la position finale du plan d'image du microscope. Étape critique: faites attention lors de l'application dentaireAcrylique / cyanoacrylate pour empêcher tout matériau de contacter l'objectif objectif du microscope, la vis de réglage ou le corps du microscope, ce qui empêchera le fonctionnement correct de l'instrumentation plus tard. Étape critique: Lors de l'application de l'adhésif, ne pas pousser sur le microscope. La pression sur le microscope ou la plaque de base peut provoquer un mouvement de l'objectif du microscope par rapport à la sonde du prisme, ce qui pourrait entraîner un désalignement ou un changement du plan focal dans le tissu qui nécessiterait un réajustement rapide. Vérifiez que l'acrylique / cyanoacrylate dentaire a durci et durci en tapotant l'acrylique avec une pince ou une pointe de seringue. Acquérir une image de fluorescence de référence finale avec le logiciel d'acquisition. Relâchez le microscope de la pince et retirez la pince du microscope. Si un cyanoacrylate ou un autre adhésif transparent a été utilisé, recouvrez-le avec un vernis noir ou une couche de ciment dentaire noir pour éviter unUne fuite de lumière minimale dans le capuchon de la tête, ce qui peut contaminer les images futures acquises lors des expériences. À ce stade, retirer le microscope si nécessaire. Pour séparer le microscope de la plaque de base, relâcher la vis de réglage de la plaque de base en tournant la vis de réglage environ ½ tour dans le sens inverse des aiguilles d'une montre. Pincez le corps du microscope tout en soutenant la plaque de base et le capuchon acrylique avec l'autre main, et tirez le microscope vers le haut. Remplacez-le dans son contenant de stockage. Protégez la sonde de prisme implantée avec un couvercle de plaque de base. Cela empêchera les particules de poussière de s'installer sur la surface de l'objectif, ce qui peut être difficile à nettoyer après l'installation de la plaque de base. Fixez le couvercle de la plaque de base sur la plaque de base et avancez la vis de réglage d'environ ½ tour dans le sens des aiguilles d'une montre ou jusqu'à ce que la vis de réglage soit alignée avec le couvercle de la plaque de base. Ne pas trop serrer. Enlevez l'animal de l'anesthésie et surveillez-le dans une chambre de réchauffement jusqu'à l'ambulatoire. RetourE animal à sa cage à domicile. Dominez tous les animaux avec des plaques de base implantées pour protéger l'implant. 5. Imagerie de plusieurs couches corticales dans une souris à mouvement libre Préparez l'appareil comportemental ( par exemple , Phenotyper, Noldus) en le nettoyant et en le désinfectant et en essuyant avec une solution d'eau de Javel à 10%. Branchez le microscope dans sa boîte DAQ et connectez-le à l'ordinateur et lancez le logiciel d'acquisition. Vérifiez l'espace de stockage de fichiers suffisant sur l'ordinateur d'acquisition et faites place aux films d'imagerie au calcium. Enregistrez directement du logiciel sur le disque dur local, plutôt que d'écrire sur un disque dur externe, pour tenir compte du taux élevé de transfert de données entre le microscope et l'ordinateur et éviter la perte de données pendant les enregistrements. Anesthésier l'animal avec de l'isoflurane (5% dans l'oxygène) dans une chambre d'induction pour attacher le microscope. Alternativement, débrouillez doucement l'animal ou utilisez une installation de tête réveilléeAvec un barreau si l'anesthésie est connue pour interférer avec le paradigme comportemental de choix. Retirez le couvercle de la plaque de base en tournant la vis de fixation de la plaque de base dans le sens inverse des aiguilles d'une montre et en soulevant le couvercle de la plaque de base. Placez le microscope dans la plaque de base sur l'animal. Le microscope doit se mettre en place à l'aide des aimants sur la plaque de base. Avancez la vis de fixation de la plaque de base jusqu'à ce qu'une légère résistance soit ressentie. Étape critique: Ne pas trop serrer la vis de fixation de la plaque de base pour éviter d'endommager le boîtier du microscope. Vérifiez le plan d'imagerie dans le tissu en acquérant un instantané de fluorescence dans le logiciel et, si nécessaire, ajustez le plan focal dans le tissu en desserrant la vis de la tourelle du microscope, en tournant la tourelle du microscope pour ajuster la mise au point fine, puis resserrer la tourelle Vis de fixation du boîtier. Étape critique: Ne forcez jamais la tourelle à tourner sans desserrer avant la vis de réglage, etNe pas trop serrer la vis de tourelle. Si vous effectuez une étude longitudinale, retournez à la position de la tourelle physique pour capturer le même champ de vision. Dans le matériel, notez le nombre de spires de la tourelle ou la position physique de la tourelle, pour chaque animal imagé avec le même microscope pour un retour rapide dans le même champ de vision. Relâchez l'animal portant le microscope dans sa cage à domicile ou dans sa chambre de comportement pour l'acclimatation, et attendez l'usure de l'anesthésie s'il y a lieu. Étape critique: entraînez les animaux à porter le poids du microscope à l'aide d'un microscope fictif pendant plusieurs séances jusqu'à ce que le port du microscope n'interfère pas avec leur comportement normal avant de commencer les séances expérimentales. Une manipulation et une formation régulières pour une réanimation réveillée empêcheront les stress des animaux. Sélectionnez les paramètres d'acquisition à utiliser pour collecter des données. Cela comprend la fraMoi pour capturer des données ( p. Ex. 20 fps, Gain de 1 et puissance LED de 50%). Vérifiez l'histogramme de l'image lors de la sélection des paramètres pour assurer un bon SNR. REMARQUE: L'ouverture numérique pour la collecte de fluorescence est de 0,35 pour la sonde de prisme 1 mm par rapport à 0,5 pour la sonde droite de 1 mm. Lancez le logiciel de comportement et programmez-le pour déclencher le microscope au cycle d'enregistrement d'imagerie désiré ( p. Ex. 4X 5 min ON 2 min OFF). Connectez le port TTL sur la boîte Noldus IO au port TRIG sur la zone DAQ via un câble RJ45 vers BNC. Placez l'animal dans l'arène de comportement s'il n'est pas déjà là et commencez l'expérience. Après avoir acquis les données souhaitées, ré-anesthésier l'animal avec de l'isoflurane (5% dans l'oxygène) dans une chambre d'induction, ou doucement réveiller l'animal. Desserrez la vis de fixation de la plaque de base et détachez le microscope de la plaque de base en tirant doucement le microscope. Replacez le couvercle de la plaque de base et serrez doucement la baseTe set screw. Retournez l'animal à la cage d'habitation jusqu'à la prochaine session d'enregistrement. Utilisez les images de fluorescence de référence comme guide pour les sessions d'imagerie suivantes pour revenir au même champ de vision. 6. Évaluation des données d'imagerie à base de Ca 2 + à grande échelle Pour extraire la localisation des cellules et la dynamique de Ca 2+ dans le champ de vision à partir des données, différentes plates-formes d'analyse de données peuvent être utilisées. Mosaic, une plate-forme d'analyse de données conçue spécifiquement pour traiter des films d'imagerie Ca 2+ à grande échelle a été utilisée pour cette étude ici. Rectifiez les pixels défectueux et interpoliez les cadres individuels abandonnés dans les films bruts dans l'étape de prétraitement. Stockez les images dans l'espace du champ de vision complet de 1 440 x 1 080 pixels à 720 x 540 pixels pour réduire l'empreinte des données. Pour corriger les artefacts de mouvement dans le cerveau par rapport au capteur d'image du microscope, enregistrez les films à l'aide d'une image rigoureuse ImageJ reAlgorithme de génération (TurboReg). Pour identifier les neurones individuels, ré-exprimer les images en tant que changements relatifs de fluorescence ΔF / F 0 = FF 0 / F 0 où F 0 est l'image moyenne obtenue en faisant la moyenne de l'ensemble du film. Identifiez les filtres spatiaux correspondant aux cellules individuelles en utilisant un algorithme de tri cellulaire établi. Nous avons utilisé l'analyse des composantes principale et individuelle 21 pour identifier les neurones individuels. REMARQUE: Un événement a été spécifié lorsque l'amplitude du pic d'un événement dans une trace était supérieure à 8 écarts types par rapport à la ligne de base de trace dans notre ensemble de données et que l'emplacement de la cellule et les données de la dynamique de Ca 2+ ont été exportées pour une analyse plus approfondie.