美国牛蛙的( 牛蛙 )允许小囊毛细胞生理学的直接检查。在这里,解剖和准备牛蛙的球囊对生物物理研究的描述。我们显示从这些毛细胞代表的实验中,其中包括一个包的力 – 位移关系的计算和测量它的非受迫运动。
听力和平衡的研究停留在从模型系统的生物物理研究中得出的见解。一个这样的模型,美国牛蛙的球囊,已成为听觉和前庭研究的中流砥柱。有这种器官的研究揭示细胞如何感觉毛可以主动从环境中检测到的信号。因为这些研究中,我们现在更好地了解机械门控和毛细胞的转导通道,钙的机械适应角色的定位,和毛细胞电流的身份。这种高度开放的器官继续提供洞察毛细胞的运作。在这里,我们描述了它的毛细胞生物物理研究牛蛙的球囊的准备。我们包括完整的解剖程序,并为在具体情况下的球囊的准备具体的协议。我们还包括使用该制剂的代表性结果,其中的计算发束的瞬发力 – 位移关系,一个包的自激振荡的测量。
哺乳动物的acousticolateralis器官具有一个复杂的结构和位于解剖利基,可以是难以进入的范围内。例如,哺乳动物耳蜗包括一个螺旋迷宫和嵌入在厚颞骨内。耳蜗的隔离常常导致位于其内的感觉细胞的机械损伤,因此,已被证明是一项困难的任务1。因而神经科学家已经转向模型,更容易从耳朵的密室提取系统。
其中一个模型系统,美国牛蛙( 牛蛙 )的球囊,几十年来取得了一般化洞察听觉和前庭系统的功能。小囊是一个混合功能的器官,在低频听力和地震的感觉都感觉的作用。所述球囊的感觉细胞是其毛细胞,将机械能转换专门的换能器到我们的听觉和前庭器官内的电信号。从每个毛细胞的顶端表面伸出是一个机械敏感毛发束,其包括称为纤毛放大微绒毛的分级刷毛束。相邻的纤毛的尖端由丝状尖链路蛋白质互相连接,机械门离子通道响应于机械性刺激2,3。虽然听觉和前庭器官的不同类型的刺激做出反应,他们都有一个共同的检测机制。这种共性underlies通过球囊牛蛙研究获得的成毛细胞机械传导的许多见解。例如,毛细胞的活性过程已被广泛这个器官4,5,6,7的研究,并且发束采用了能量消耗的过程,以产生机械工作。它不仅被证明,毛细胞产生积极工作6,但在活动过程基本不同的机制和毛细胞的调谐特性已经通过牛蛙acousticolateralis器官的研究亮相。这些包括有源毛发束蠕动8和毛细胞电共振9,10,在球囊11和频率选择性在所述水陆两用车辆乳头毛细胞的色带突触12。
牛蛙的球囊吸引的原因很多感官神经科学家。不同于哺乳动物耳蜗,这个器官位于易于接近耳胶囊内。其次,本机关内毛细胞可以在适当的条件下,13保持了几个小时健康,14。这使得experimentat离子对这些细胞在相对其同行哺乳动物长的时间尺度。三,器官熊小弧度,允许容易操控。第四,每个器官包括一千或更多毛细胞15,同时提供高通量和定位一组适当的毛细胞对于给定实验的可能性高。最后,牛蛙的球囊很容易由于其毛细胞这个器官和大尺寸的薄可视化。
这些特性提供了感觉细胞的牛蛙的球囊内的研究具有通用性。取决于手边的问题,有几个实验制剂中的一个可从球囊中获得。其中最简单的是单腔室制备。在这里,球囊固定在充满人工外淋巴液,丰富的钠和高钙盐水室。这种准备使毛细胞电流和基本的发束力学研究。第二结构中,两个腔制剂,可用于研究自然发束运动。这里毛细胞的顶面暴露于钾富和钙差盐水称为人工内淋巴,而基底外侧面在人工外淋巴沐浴。这两个隔室模拟生理盐水, 在体内的装置和提供允许发束自发振荡的环境。
我们在本文中描述了牛蛙的球囊为它的感觉毛细胞生物物理研究的准备。我们首先提供了从青蛙的内耳这个器官的孤立的详细描述。然后,我们描述了两个单组分和双室的实验准备工作和包括每个配置代表性的结果。
在牛蛙的球囊骗几千易于访问的感觉毛细胞。这里,我们证明提取和准备球囊为单组分和双室录音。这两种制剂使毛细胞及其相关的束微机械都和电生理研究。由于组织可以与频繁更换充氧的生理盐水几个小时生存,实验可能会持续较长的时间。在这些制剂中毛细胞通常为微电极记录解剖后长达6小时保持存活,而发束振荡自发进行萃取后长达24小时。
小囊的成功提取和安装有赖于克服一些共同的挑战。首先,在囊状黄斑的顶表面直接接触应在整个制备过程来避免。囊状神经提供了安全manipu方便的提手小囊的相关特征研。一旦从所述内耳器官的其余部分释放,所述球囊应采用大口径吸管而其余浸入流体以避免其感觉上皮机械损伤进行传输。耳石从黄斑表面除去必须无毛细胞机械损伤完成。因为耳石直接躺在上面斑,毛发细胞可以通过清扫工具,并在除去耳石的耳石膜之间的意外接触而损坏。为了避免损坏,我们建议耳石的凝胶状物质被在位置远离黄斑保持并作为单质除去。这避免了otoconial质量碎裂成无数集群,其中每个将被单独提取。如果耳石的小簇保持它们可以与由巴斯德吸管输送柔和流体压力被除去。最后一个挑战涉及密封在小囊和铝安装方之间形成双室制备。采用具有穿孔足够小以允许的球囊和周围铝许可证的组织的完全密封之间约100μm的重叠的正方形。胶应,以便形成紧密的密封可接触与约100微米左右的黄斑的周边囊状组织。
游离的Ca 2+浓度是在毛细胞研究中的一个重要考虑因素。 的 Ca 2+调节快速和缓慢适应,从而确定机械传导装置的动力学和的发束的有源处理现象的特征,包括自发束运动8,23。 体内钙的膜迷路积水出现在250微米,因此最生理有关动力学在此浓度(茂盛JHR,R.雅各布和AJ Hudspeth评估。UnpublisHED观察16)。然而,从毛细胞微电极记录需要外部的钙浓度超过2毫米左右的微细胞膜的正常密封。因此,必须使用高钙生理盐水这些实验。最后,我们不妨来研究细胞外钙的在机械传导采用多种钙离子浓度的影响。在这些情况下,重要的是记住低于1μM钙浓度通常会导致末梢链路破裂和转导28的不可逆损失是很重要的。
这里所描述的两个实验准备允许的范围内对毛细胞生物物理测量。然而,额外的测量可以用稍微修改这些制剂制成。在折叠囊状制剂,头发束横向可视化。从这样的高度成像头发束运动揭示连贯MOT短期和高大的纤毛29的离子。在这里,囊状黄斑首先从它的底层组织中分离,随后沿着囊状神经,使发束朝外,并在折痕横向可视化定义的轴折叠。第二个修改,毛细胞分离,使双方的毛细胞的软件包及其胞体的研究。毛细胞机械分离到用于成像和电生理记录30载玻片。最后,毛细胞可以从上皮通过遵循类似的解离协议,但没有机械解离步骤挤出。该处理导致毛细胞逐渐挤压出来的上皮,提供电生理记录基底访问,同时尽量减少机械损伤。这些制剂和它们的许多修改演示青蛙球囊的通用性,作为生物物理的模型系统感觉毛细胞的研究。
The authors have nothing to disclose.
The authors wish to acknowledge Dr. A. J. Hudspeth for funding and expertise in developing the preparations described in this paper. We also wish to thank Brian Fabella for creating and maintaining much of the custom equipment and software used in this protocol.
J. B. A. is supported by grant F30DC014215, J. D. S. is supported by grant F30DC013468, and both J. B. A. and J. D. S. are supported by grant T32GM07739 from the National Institutes of Health.
Common to both preparations | |||
Stereo-dissection microscope | Leica | MZ6 | Other sources can be used |
Tricaine methanesulfonate | Sigma | E10521 | Other sources can be used |
Metal pithing rod | Fine Science Tools | 10140-01 | |
Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
Glass Pasteur pipette and bulb (x2) | Fisher Scientific | 22-042816 | |
Fine eyelash mounted on a hypodermic needle | Fisher Scientific | 22-557-172 | |
Dow-corning vacuum grease | Fisher Scientific | 14-635-5C | |
Syringe for vacuum grease | Fisher Scientific | 14-829-45 | Other sources can be used |
35 mm Petri dish (x2-3) | Fisher Scientific | 08-772A | Other sources can be used |
Micropipette puller | Sutter | P-97 or P-2000 | |
120 V Solenoid puller | Home-made, see parts list | ||
Sputter coater | Anatech USA | Hummer 6.2 | |
Current source for iontophoresis | Axon Instruments | AxoClamp 2B | Other sources can be used |
Piezoelectric actuator | Piezosystem Jena | P-150-00 | |
Amplifier for piezoelectric actuator | Piezosystem Jena | ENV800 | |
Borosilicate glass capillary | World Precision Instruments | 1B120F-3 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
For one-chamber preparation | |||
Microelectrode amplifier | Axon Instruments | AxoClamp 2B | Can be used for iontophoresis and microelectrode recordings simultaneously |
Magnetic pins (x2) | Home-made, see parts list | ||
Open-top chamber with magnetic sheet | Home-made, see parts list | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
For two-chamber preparation | |||
Upper chamber | Supplementary file 1 | ||
Troughed lower chamber | Supplementary file 2 | ||
Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | Other sources can be used |
Mounting block | Supplementary file 3 | ||
Wooden applicator sticks | Fisher Scientific | 23-400-112 | Other sources can be used |
Teflon sheet | McMaster-Carr | 8545K12 | For teflon applicator |
Cyanoacrylate glue | 3M | 1469SB | |
Lab tissues (Kimwipes) | Fisher Scientific | 06-666A | Other sources can be used |
Gentamicin sulfate | Sigma-Aldrich | G1914 | Other sources can be used |
Quick-setting epoxy | McMaster-Carr | 7605A18 | |
18 mm glass coverslips | Fisher Scientific | 12-546 | Other sources can be used |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Saline components | |||
NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | Other sources can be used |
KCl | Sigma-Aldrich | P4504-500G | Other sources can be used |
CaCl2 • 2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Other sources can be used |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | Other sources can be used |
D-(+)-glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Other sources can be used |
Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Parts lists for home-made equipment | |||
Solenoid puller | |||
Solenoid | Guardian Electric | A420-065426-00 | Other sources can be used |
Foot-pedal switch | Linemaster | T-51-SC36 | Other sources can be used |
Pipette holder | World Precision Instruments | MEH900R | Other sources can be used |
Coarse manipulator | Narishige Group | MM-3 | Other sources can be used |
Platinum wire | Alfa Aesar | 25093 | Other sources can be used |
Power supply | Leica | Z050-261 | Other sources can be used |
Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Magnetic pins | |||
Epoxy | McMaster-Carr | 7556A33 | Other sources can be used |
1 mm thickness aluminum | McMaster-Carr | 89015K45 | Other sources can be used |
Insect pins | Fine Science Tools | 26000-40 | Other sources can be used |
Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Open-top magnetic chamber | |||
Flexible magnetic strip | McMaster-Carr | 5759K75 | Other sources can be used |
1 mm thickness aluminum | McMaster-Carr | 89015K45 | Other sources can be used |