الطريقة المعروضة هنا يصف قابلة للوالممارسات التصنيعية الجيدة (GMP) -ready نظام المفاضلة لتوليد مثل الكبدية الخلايا البشرية من الخلايا الجذعية المحفزة. وهو بمثابة نظام فعالة من حيث التكلفة وموحدة لتوليد مثل الكبدية الخلايا البشرية للبحث كبد الإنسان الأساسية والتطبيقية.
الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSCs) تمتلك قيمة كبيرة لبحوث الطب الحيوي. hPSCs يمكن تحجيمها ومتباينة لجميع أنواع الخلايا الموجودة في جسم الإنسان. وقد درس على نطاق واسع تمايز hPSCs إلى خلايا تشبه خلايا الكبد البشرية (ثوابت قانون هنري هي)، وأنشئت بروتوكولات التمايز فعالة. جعلت مجموعة من المصفوفة خارج الخلية والمحفزات البيولوجية، بما في ذلك عوامل النمو، السيتوكينات، والجزيئات الصغيرة، من الممكن لتوليد ثوابت قانون هنري هي التي تشبه خلايا الكبد البشرية الأساسية. ومع ذلك، فإن معظم الإجراءات لا تزال تستخدم مكونات غير محددة، مما أدى إلى تباين دفعة إلى دفعة. وهذا بمثابة عائقا كبيرا أمام تطبيق هذه التكنولوجيا. لمعالجة هذه القضية، قمنا بتطوير نظام محدد للتمايز الكبدية باستخدام laminins البشرية المؤتلفة كما مصفوفات خارج الخلية في توليفة مع عملية التمايز خالية من المصل. غاية وقد تحقق كفاءة مواصفات الكبدية، مع ديmonstrated إدخال تحسينات على كل وظيفة HLC والنمط الظاهري. الأهم من ذلك، هذا النظام سهل لزيادة استخدام البحث وGMP الصف خطوط hPSC التقدم واعدة في مجال النمذجة خلية القاعدة والعلاجات.
وتستخدم الأنسجة البشرية الأساسية وأنواع الخلايا المشتقة بانتظام، سواء بالنسبة للفحص خلية القاعدة وفي العيادة. ومع ذلك، والحصول على هذه الخلايا ومحدودة للغاية بسبب عدم كفاية التبرع بالأعضاء وفقدان الظواهر الخلايا بعد العزلة 1. تمثل hPSCs بديلا واعدا للأنسجة الأساسية وتسهيل جيل من الخلايا الجسدية البشرية المحددة وراثيا والمتجددة. وقد أظهرت مثل الكبدية الخلايا (ثوابت قانون هنري هي) المستمدة من hPSCs بالفعل وعد في هذا المجال. ثوابت قانون هنري هي تشبه خلايا الكبد البشرية الأساسية في مختلف الجوانب، بما في ذلك شكل الخلية، التعبير الجيني الكبدية، وظيفة التمثيل الغذائي، والحساسية للأدوية والفيروسات 2، 3، 4، 5، 6، 7، 8. وبالإضافة إلى ذلك، وانتشار غير محدود وقدرة التجديد الذاتي لكلا hPSCs البحوث وGMP الصف يسهل تطبيقها 9 و 10.
وقد أنتجت أكثر من عشر سنوات من الأبحاث على عدد من الإجراءات تمايز الكبدية كفاءة 2، 3، 5، 11، 12، 13، 14، 15، 16، 17، 18، 19، 20. ومع ذلك، فإن معظم هذه النظم تستخدم مكونات غير محددة و / أو تنبيغ الفيروسية لدفع مواصفات الخلايا الكبدية. لتحسين موثوقية التكنولوجيا على نطاق واسع، فمن المهم وضع تمايز الكبدية قويالنظام الذي يعرف حقا، خالية من XENO، وبرنامج الرصد العالمي متوافق.
Laminins (LNS) هي مهمة البروتينات المصفوفة خارج الخلية التي يمكن أن تؤثر على التصاق الخلايا وانتشار، والهجرة، والتمايز. Laminins هي بروتينات سكرية heterotrimeric تتألف من α واحد، β واحدة، وسلسلة γ واحد. في الآونة الأخيرة، وقد تم إنتاج laminins الإنسان المؤتلف واستخدامها في بيولوجيا الخلية. وقد تبين LN-511 لدعم صيانة hPSCs 21، في حين خليط من LN-521 و E-كادهيرين يسمح الاشتقاق نسيلي وتوسيع الخلايا الجذعية الجنينية البشرية 22. LN-111، من ناحية أخرى، ويدعم الحفاظ على خلايا تشبه أرومة كبدية المستمدة من hPSCs 23. ومع ذلك، قبل تقريرنا، laminins 521 و 111 لم تستخدم لتوليد ثوابت قانون هنري هي ذات الخصائص ناضجة من hPSCs 10.
هنا، نحن الإجراءات التفاصيل لزراعة hPSCs على LN-521والتفريق بينها على أي LN-521 أو مزيج من LN-521 و LN-111 (LN-521 / LN-111). نحن الأمثل بروتوكول التمايز باستخدام البذر وحيدة الخلية لتوليد أحادي الطبقة استنساخه للغاية ومتجانسة من ثوابت قانون هنري هي في العديد من الأشكال (14). ونحن نعتقد أن لدينا نظام المفاضلة المحددة يمثل طريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة لتصنيع ثوابت قانون هنري هي النشطة للتطبيق، وهو ما يمثل خطوة هامة إلى الأمام في هذا المجال.
لتعزيز البحوث الإنسان المحفزة الخلايا الجذعية والطب متعدية، نظم خالية من XENO التي تتوافق مع مطلوبة المبادئ التوجيهية الحالية الممارسات التصنيعية الجيدة. مفتاح أي عملية التمايز هو المصفوفة خارج الخلية (ECM). إدارة المحتوى في المؤسسة ليس فقط يدعم مرفق الخلية، ولكنها توفر أيضا إمكانية الوصول إلى عوامل الإشارات الرئيسية، والتأثير على تحديد الخلايا والنمط الظاهري 25، 26.
Laminins هي متعددة الوظائف البروتينات المصفوفة خارج الخلية في الجسم الحي. في الكبد، وإفراز Laminin الحالي هو الحاسم لتجديد الكبد بعد استئصال الكبد الجزئي 27 ومطلوب لالسلف الكبدي صيانة خلية 28. كانت أهمية laminins في صيانة الكبد وتجديد أساس لاختبار المتاحة تجاريا laminins الإنسان المؤتلف في نظام الكبدية التمايز لدينا.
متفوقة انهوقد تحقق patocyte التمايز على LN-521 و LN-521 / LN-111 ركائز بالمقارنة ل Matrigel. تم الاستقطاب ثوابت قانون هنري هي مشتقة بشكل واضح ومنظم في الطبق، وتحسين وظيفة الخلوية بشكل كبير بالمقارنة مع نظرائهم هلامية البروتين الخليط. الكامنة وراء هذه التحسينات كانت downregulation من تلويث colon-، fibroblast- ووقف جينات الخلايا المرتبطة على laminins، وكذلك انخفاض في تكاثر الخلايا والجينات الهجرة المرتبطة 10.
في الختام، بروتوكول صفها هنا يولد خلايا تشبه خلايا الكبد التي هي أقرب في طبيعتها إلى خلايا الكبد البشرية الكبار. هذه العملية هي قابلة للتكرار، قابلة للأتمتة، ويمكن زيادتها لتطبيق فعالية من حيث التكلفة. الأهم من ذلك، تم خفض التباين دفعة إلى دفعة بشكل ملحوظ بالمقارنة مع التقنيات التي تستخدم Matrigel، مما نتج عنه نظام التمايز محسن للباحثين في هذا المجال. </P>
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل مع جوائز من الطب التجديدي منصة المملكة المتحدة (MRC MR / L022974 / 1 و MR / K026666 / 1) ومنحة الصين.
Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 |
Human Recombinant Laminin 111 | BioLamina | LN111-02 |
Recombinant mouse Wnt3a | R&D Systems | 1324-WN-500/CF |
Human Activin A | Peprotech | 120-14E |
Human Hepatocyte Growth Factor | Peprotech | 100-39 |
Human Oncostatin M | Peprotech | 300-10 |
Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG |
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma-Aldrich | H4881 |
DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 |
mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 05850 |
RPMI 1640 | Life Technologies | 21875 |
Knockout DMEM | Life Technologies | 10829 |
HepatoZYME | Life Technologies | 17705 |
B27 supplement | Life Technologies | 12587-010 |
Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828 |
GlutaMax | Life Technologies | 35050 |
Non-essential amino acids | Life Technologies | 11140 |
2-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350 |
Accutase | Millipore | SCR005 |
DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 |