El método presentado aquí describe un sistema de diferenciación -ready prácticas de fabricación escalable y bueno (GMP) para generar células hepatocitos como las humanas a partir de células madre pluripotentes. Sirve como un sistema rentable y estandarizado para generar células hepatocitos humanos para la investigación, como el hígado humano básico y aplicado.
Las células madre pluripotentes humanas (hPSCs) poseen un gran valor para la investigación biomédica. hPSCs se pueden escalar y diferenciada a todos los tipos de células encontradas en el cuerpo humano. La diferenciación de las células humanas hPSCs a hepatocitos como las (HLC) ha sido ampliamente estudiada, y se han establecido protocolos de diferenciación eficientes. La combinación de la matriz extracelular y los estímulos biológicos, incluyendo factores de crecimiento, citoquinas y moléculas pequeñas, han hecho posible la generación de HLC que se asemejan a hepatocitos humanos primarios. Sin embargo, la mayoría de los procedimientos todavía emplean componentes no definidos, dando lugar a la variación de lote a lote. Esto sirve como una barrera importante para la aplicación de la tecnología. Para abordar esta cuestión, hemos desarrollado un sistema definido para la diferenciación de hepatocitos humanos recombinantes utilizando laminina como matrices extracelulares en combinación con un proceso de diferenciación exento de suero. Fácilmente se logró la especificación de hepatocitos eficiente, con Demonstrated mejoras tanto en la función HLC y el fenotipo. Es importante destacar que este sistema es fácil de ampliar el uso de investigación y GMP-grado líneas HPSC avances prometedores en el modelado y terapias basadas en células.
tejidos humanos primarios y los tipos de células derivados se utilizan regularmente, tanto para el cribado basado en células y en la clínica. Sin embargo, el acceso a estas células es muy limitada debido a la insuficiencia de la donación de órganos y la pérdida de fenotipos de células post-aislamiento 1. hPSCs representan una alternativa prometedora a los tejidos primarios y facilitar la generación de células somáticas humanas genéticamente definidos y renovables. células hepatocitos como las (HLC) derivados de hPSCs ya han demostrado ser prometedores en este campo. HLC asemejan a hepatocitos humanos primarios en diversos aspectos, incluyendo la morfología celular, la expresión génica de los hepatocitos, la función metabólica, y la sensibilidad a los medicamentos y virus 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. Además, la proliferación ilimitada ycapacidad de auto-renovación de las dos hPSCs investigadores y GMP-grado facilita su aplicación 9, 10.
Más de una década de investigación ha producido una serie de procedimientos de diferenciación de hepatocitos eficiente 2, 3, 5, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20. Sin embargo, la mayoría de estos sistemas utilizan componentes no definidos y / o transducción viral para conducir especificación hepatocelular. Para mejorar la fiabilidad de la tecnología a escala, es importante desarrollar una sólida diferenciación de hepatocitossistema que está realmente definido, libre de xeno, y compatible con GMP.
Lamininas (LNS) son importantes proteínas de matriz extracelular que pueden influir en la adhesión celular, la proliferación, migración y diferenciación. Lamininas son glicoproteínas heterotriméricas compuestas de una α, β uno, y una cadena γ. Recientemente, lamininas humanos recombinantes se han producido y utilizado en la biología celular. LN-511 se ha demostrado para apoyar el mantenimiento de hPSCs 21, mientras que una mezcla de LN-521 y E-cadherina permite derivación clonal y la expansión de células madre embrionarias humanas 22. LN-111, por otra parte, con el mantenimiento de las células hepatoblastos-como derivados de hPSCs 23. Sin embargo, antes de que nuestro informe, laminina 521 y 111 no se habían utilizado para generar HLC con características maduras a partir de 10 hPSCs.
En este sentido, detallan los procedimientos para el cultivo de hPSCs en LN-521y diferenciarlas en cualquiera de LN-521 o una mezcla de LN-521 y LN-111 (LN-521 / LN-111). Hemos optimizado el protocolo de diferenciación mediante la siembra de una sola célula para generar una monocapa altamente reproducible y homogénea de HLC en muchos formatos 14. Creemos que nuestro sistema de diferenciación definido representa un método sencillo y rentable para la fabricación de HLC activos para su aplicación, lo que representa un importante paso adelante en el campo.
Para avanzar en la investigación humana de células madre pluripotentes y la medicina traslacional, sistemas libres de xeno que cumplen con las directrices se requieren buenas prácticas de fabricación actuales. Clave para cualquier proceso de diferenciación es la matriz extracelular (ECM). El ECM no sólo es compatible con la unión celular, sino que también proporciona acceso a los factores de señalización clave, que influyen en la determinación de células y el fenotipo 25, 26.
Laminina son proteínas de la matriz extracelular in vivo multifuncionales. En el hígado, la secreción de la laminina es crucial para la regeneración del hígado después de una hepatectomía parcial 27 y es necesario para el mantenimiento de células progenitoras hepáticas 28. La importancia de laminina en el mantenimiento y la regeneración del hígado fue la base para las pruebas disponibles comercialmente laminina humana recombinante en nuestro sistema de diferenciación de hepatocitos.
Superior élla diferenciación patocyte se logró el LN-521 y LN-521 / LN-111 sustratos, en comparación con Matrigel. HLC derivados fueron claramente polarizados y organizados en el plato, y su función celular se mejoró significativamente en comparación con sus homólogos de mezcla de proteínas gelatinosas. Detrás de estas mejoras fue la regulación a la baja de contaminar Colon-, fibroblast- y el vástago genes asociados a células en las lamininas, así como una disminución en la proliferación celular y la expresión génica asociada a la migración 10.
En conclusión, el protocolo descrito aquí genera células hepatocitos como las que están más cerca de la naturaleza de los hepatocitos humanos adultos. El proceso es reproducible, susceptibles de automatización, y se pueden ampliar para su aplicación de manera rentable. Es importante destacar que, la variación de lote a lote se ha disminuido de manera significativa en comparación con las técnicas que utilizan Matrigel, resultando en un sistema de diferenciación mejorado para los investigadores en este campo. </p>
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado con premios de la Medicina Regenerativa Plataforma Reino Unido (MRC MR / L022974 / 1 y MR / K026666 / 1) y una beca de China.
Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 |
Human Recombinant Laminin 111 | BioLamina | LN111-02 |
Recombinant mouse Wnt3a | R&D Systems | 1324-WN-500/CF |
Human Activin A | Peprotech | 120-14E |
Human Hepatocyte Growth Factor | Peprotech | 100-39 |
Human Oncostatin M | Peprotech | 300-10 |
Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG |
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma-Aldrich | H4881 |
DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 |
mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 05850 |
RPMI 1640 | Life Technologies | 21875 |
Knockout DMEM | Life Technologies | 10829 |
HepatoZYME | Life Technologies | 17705 |
B27 supplement | Life Technologies | 12587-010 |
Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828 |
GlutaMax | Life Technologies | 35050 |
Non-essential amino acids | Life Technologies | 11140 |
2-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350 |
Accutase | Millipore | SCR005 |
DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 |