Summary

Качественный и количественный анализ иммунной синапсов в системе человека с использованием визуализации проточной цитометрии

Published: January 07, 2019
doi:

Summary

Здесь мы описываем полный рабочий процесс для качественного и количественного анализа иммунных синапсов между основной человеческий Т-клеток и антиген представляющих клеток. Метод основан на визуализации проточной цитометрии, который позволяет приобретение и оценки нескольких тысяч клеток изображений в течение относительно короткого периода времени.

Abstract

Иммунная синапса — это область коммуникации между Т-клеток и антиген представляющих клеток (БТР). Т-клетки поляризовывайте поверхности рецепторы и белков к иммунной СИНАПС для обеспечения стабильного привязки и сигнал обмен. Классическая конфокальный, TIRF или суперразрешением микроскопии были использованы для изучения иммунной синапсе. Поскольку эти методы требуют ручной изображения приобретение и длительным количественной оценки, изображений редких событий является сложной задачей. Здесь мы описываем рабочий процесс, который позволяет морфологический анализ десятки тысяч клеток. Иммунные синапсы наведены между первичной клетки человека T в Пан лейкоцита препаратов и золотистый стафилококк энтеротоксинов B SEB-загружен Раджи клетки как БТР. Получение изображения производится с изображений проточной цитометрии, также называется микроскопии в поток, который сочетает в себе черты проточный цитометр и флуоресцентным микроскопом. Предоставляется полный стробирования стратегию для выявления клеток T/APC пары и анализа иммунной синапсы. Как этот рабочий процесс позволяет анализ иммунной синапсов в подготовке неочищенную Пан лейкоцитов и поэтому требует лишь небольшого количества крови (т.е., 1 мл), он может применяться для образцов от пациентов. Важно отметить, что несколько образцов можно подготовлен, измеряется и проанализированы параллельно.

Introduction

Т-клетки являются основными регуляторами адаптивной иммунной системы и активируются через антигенные пептиды, которые представлены в контексте комплексов гистосовместимости (MHC). Полная активация Т-клеток требует двух сигналов, компетенции сигнал через антиген специфические Т-клеточных рецепторов (TCR) / CD3 комплекса и костимуляторных сигнала через аксессуар рецепторов. Обе сигналы генерируются путем непосредственного взаимодействия Т-клеток с антиген представляющих клеток (БТР). Зрелые БТР обеспечивают компетенции сигнал для активации Т-клеток через MHC-пептидных комплексов, и они выражают костимуляторных лигандами (например, CD80 или CD86) заверить прогрессирование Т-клеток активации1. Одной из важных функций костимуляции является перераспределение актина цитоскелета2,3,4. Корковых F-актина относительно статичной в отдыхая Т-клеток. Т-клеточная стимуляция через антиген подшипник БТР приводит к глубокой перестройки Цитоскелет актина. Актина динамика (т.е., быстро актина полимеризации/деполимеризации круги) позволяют Т-клетки для создания сил, которые используются для перевозки белки или органеллы, например. Кроме того Цитоскелет актина имеет важное значение для разработки специальной контактной зоны между Т-клеток и БТР, называется иммунной синапсе. Ввиду важности Цитоскелет актина в иммунной синапса стало необходимо разработать методы количественной оценки изменений в Цитоскелет актина T клетки5,6,,78 , 9.

С помощью актина цитоскелета помощи поверхности рецепторы и сигнализации белки подвергаются сегрегации в супрамолекулярные активации кластерах (SMACs) в пределах иммунной синапса. Стабильность иммунной синапса обеспечивается путем связывания рецепторов к F-актина расслоений, которые повышают эластичность Цитоскелет актина. Было показано, что формирование иммунной синапса иметь решающее значение для поколения адаптивного иммунного ответа. Пагубные последствия формирования дефектных иммунной синапсов в естественных условиях были впервые реализованы в пациентов, страдающих от синдром Вискотта-Олдрича синдром (WAS), заболевание в котором актина полимеризации и сопутствующе обстоятельств, нарушается формирование иммунной синапса10 . Последнее, что пациенты могут страдать от экземы, тяжелой инфекции, аутоиммунные заболевания и меланомы. Несмотря на этот вывод, в настоящее время не известно, отличается ли формирование иммунной синапсов в Т-клетки здоровых лиц и пациентов, страдающих от иммунные дефекты или аутоиммунных заболеваний.

Микроскопии флуоресцирования, включая конфокальный, TIRF и микроскопии суперразрешением, были использованы для раскрыть архитектура иммунной синапса11,12,,1314. Высокое разрешение этих систем и возможность выполнения клеток позволяет коллекции точно, пространственно временной информации о Цитоскелет актина и поверхности или внутриклеточных белков в иммунной синапсе. Многие результаты, однако, основаны на анализе лишь несколько десятков Т-клеток. Кроме того Т-клетки должны быть очищены для этих типов микроскопии флуоресцирования. Однако для многих исследований вопросов, неочищенную клетки, вместо того, чтобы резолюции максимально используется исключительно важное значение. Это актуально, если анализируются Т-клетки от пациентов, поскольку объем донорской крови, ограничен и может быть необходимость обработки множества образцов параллельно.

Мы создали микроскопические методы, которые позволяют проводить анализ Цитоскелет актина в синапсе иммунной системы человека15,16,17. Эти методы основаны на визуализации проточной цитометрии, также называется в поток микроскопии18. Как гибрид между многоспектральных потока цитометрии и флуоресцентной микроскопии, визуализации проточной цитометрии имеет свои сильные стороны в анализе морфологических параметров и локализация протеина в гетерогенных клеточных популяций, как Пан лейкоцитов из периферической крови. Мы ввели методологии, которая позволяет нам дать количественную оценку F-актина в T-клеток/APC конъюгатов человеческих клеток T пробах цельной крови, без необходимости длительной и дорогостоящей очистки шагов17. Техника, представленная здесь включает в себя весь рабочий процесс, от получения образца крови для количественной оценки F-актина в иммунной синапсе.

Protocol

1. Подготовка Пан лейкоциты Нарисуйте 1 мл периферической крови здоровых доноров (или пациента) гепаринизированным шприца. Убедитесь в том иметь одобрение Комитетом ответственных этики донорства крови. Смешайте 1 мл человека периферической крови с 30 мл буфера lysis ACK (150 мм NH4<…

Representative Results

Основная цель метода, описанного здесь является количественная оценка белка обогащения (например, F-миозина) в иммунной синапса между суррогатной БТР (Раджи клетки) и T-клетки в неочищенную Пан лейкоциты, взяты из образцов человеческой крови низким объемом (1 мл). Сн…

Discussion

Работы, представленные здесь позволяет количественная оценка иммунной синапсы человека Т-клетки (ex vivo) и БТР. В частности эритроцитов лизированы Пан лейкоциты были использованы в качестве источников Т-клеток, делает шаги очистки Т-клеточная необязательный. Линия B-клеточной лимфомы кл?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Работа финансировалась немецкого научного Совета (DFG) с грантов нет SFB-938-M и SA 393/3-4.

Materials

>Multifuge 3 SR Heraeus
RPMI 1640 LifeTechnologies #11875085 500 mL
FCS Pan Biotech#3302-P101102
Polystyrene Round Bottom Tube Falcon #352054 5 mL
Kulturflasche Thermo Scientific #178883
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Sigma D8662
Bovine Serum Albumin Roth #8076.3
Saponin Sigma S7900
Paraformaldehyde Sigma Aldrich #16005
FACS Wash Saponin PBS 1% BSA 0.15 Saponin
ReaktiosgefaB Sarstedt 72.699.002 0.5 mL
Speed Bead Amnis #400041
Minishaker MS1 IKA Works  MS1
Mikrotiterplatte Greiner Bio One #650101 96U
Enterotoxin SEB Sigma Aldrich S4881
DAPI Sigma Aldrich D9542 1:3000
CD3-PeTxR Invitrogen MHCD0317 1:30
Phalloidin-AF647 Molecular Probes A22287 1:150
IS100 Amnis Imaging flow cytometer
IDEAS Amnis Software
INSPIRE Amnis Software

Referenzen

  1. Esensten, J. H., Helou, Y. A., Chopra, G., Weiss, A., Bluestone, J. A. CD28 Costimulation: From Mechanism to Therapy. Immunity. 44 (5), 973-988 (2016).
  2. Samstag, Y., Eibert, S. M., Klemke, M., Wabnitz, G. H. Actin cytoskeletal dynamics in T lymphocyte activation and migration. Journal of leukocyte biology. 73 (1), 30-48 (2003).
  3. Samstag, Y., John, I., Wabnitz, G. H. Cofilin: a redox sensitive mediator of actin dynamics during T-cell activation and migration. Immunol Rev. 256 (1), 30-47 (2013).
  4. Comrie, W. A., Burkhardt, J. K. Action and Traction: Cytoskeletal Control of Receptor Triggering at the Immunological Synapse. Front Immunol. 7, 68 (2016).
  5. Piragyte, I., Jun, C. D. Actin engine in immunological synapse. Immune Netw. 12 (3), 71-83 (2012).
  6. Rossy, J., Pageon, S. V., Davis, D. M., Gaus, K. Super-resolution microscopy of the immunological synapse. Curr Opin Immunol. 25 (3), 307-312 (2013).
  7. Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy. J Vis Exp. (85), (2014).
  8. Comrie, W. A., Babich, A., Burkhardt, J. K. F-actin flow drives affinity maturation and spatial organization of LFA-1 at the immunological synapse. J Cell Biol. 208 (4), 475-491 (2015).
  9. Markey, K. A., Gartlan, K. H., Kuns, R. D., MacDonald, K. P., Hill, G. R. Imaging the immunological synapse between dendritic cells and T cells. J Immunol Methods. 423, 40-44 (2015).
  10. Bouma, G., Burns, S. O., Thrasher, A. J. Wiskott-Aldrich Syndrome: Immunodeficiency resulting from defective cell migration and impaired immunostimulatory activation. Immunobiology. 214 (9-10), 778-790 (2009).
  11. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
  12. Dustin, M. L., Depoil, D. New insights into the T cell synapse from single molecule techniques. Nature reviews. Immunology. 11 (10), 672-684 (2011).
  13. Mace, E. M., Orange, J. S. New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques. Front Immunol. 3, 421 (2012).
  14. Yokosuka, T., et al. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).
  15. Wabnitz, G. H., et al. Sustained LFA-1 cluster formation in the immune synapse requires the combined activities of L-plastin and calmodulin. European journal of immunology. 40 (9), 2437-2449 (2010).
  16. Wabnitz, G. H., et al. L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells. Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).
  17. Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse. J Immunol Methods. , (2015).
  18. Basiji, D., O’Gorman, M. R. Imaging flow cytometry. J Immunol Methods. 423, 1-2 (2015).
  19. Wabnitz, G. H., Samstag, Y. Multiparametric Characterization of Human T-Cell Immune Synapses by InFlow Microscopy. Methods Mol Biol. 1389, 155-166 (2016).
  20. Balta, E., et al. Qualitative and quantitative analysis of PMN/T-cell interactions by InFlow and super-resolution microscopy. Methods. , (2016).
  21. Hochweller, K., et al. Dendritic cells control T cell tonic signaling required for responsiveness to foreign antigen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5931-5936 (2010).
  22. Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Wabnitz, G., Kirchgessner, H., Samstag, Y. Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (143), e55345, doi:10.3791/55345 (2019).

View Video