Summary

병 코 돌고래 (Tursiops truncatus) 정 충: Cryopreservation, 수집과 Heterologous 체 외에서 수정

Published: August 21, 2017
doi:

Summary

여기, 우리는 돌고래 정 충, cryopreservation, 수집과 소 oocytes를 사용 하 여 분리 IVF 성능을 위해 성공적으로 사용 된 프로토콜을 제시.

Abstract

Cryopreserved 돌핀 정 충의 사용 수 중 공원 사이 유전 물질의 교환을 용이 하 게 하 고 정 충은 해양 포유 동물 복제에 대 한 우리의 이해를 심화 하기 위해 연구 실험실에 액세스할 수 있습니다. 분리 IVF, 동종 IVF에 대 한 대체 잠재적인; 정자 비 옥을 테스트 하는 수단을 제공할 수 있습니다. 연구 생식 체 생리학 및 초기 배아 발달; 그리고 얻기 어려운 귀중 한 돌고래 oocytes의 사용을 피하기 위해. 여기, 우리는 성공적으로 수집 하 고 돌고래 정 충 cryopreserve 사용 된 프로토콜을 제시. 정액의 컬렉션은 훈련 된 돌고래에 수동 자극에 의해 수행 됩니다. Cryopreservation은 글리세롤과 트리 스 달걀 노른자위 기반 extender를 사용 하 여 수행 됩니다. 또한, 우리는 분리 IVF 돌고래 정 충와 소 oocytes를 사용 하 여 설명 하 고는 PCR를 사용 하 여 결과 배아의 하이브리드 성격을 확인 하는 프로토콜을 제시. 분리 수정 수정에 대 한 질문을 제기 하 고 생식 체 생리학과 초기 배아 발달을 공부 하는 도구로 사용 될 수 있습니다. 또한, 분리 IVF의 성공 테스트 돌고래 정자 비 옥 하 게 용량을 추가 검사의 가치가이 기술의 잠재력을 보여 줍니다.

Introduction

보조 생식 기술 해양 포유류를 포함 하 여 야생 동물에 가난 하 게 개발 된다. 정자 기름 성공 평가에 중요 한 방법의 부족 느린 돌고래 종에서 생식 기술 개발에 기여 한다. 그것은 아니었다 최근까지 bottlenose 돌고래 (Tursiops truncatus)의 기본 정액 매개 변수 보고1,2했다. 그러나, 운동 성 및 형태학, 같은 변수 널리 사용 되 고 있지만 생식 효율성에 제한 된 정보 제공. 정자 품질 최고의 지표는 기름 잠재력의 평가.

최근, 우리의 그룹 돌고래 정자 남성 pronuclear 형성 및 zona 그대로 소 oocytes3를 사용 하 여 분리 IVF 후 하이브리드 배아 형성 평가 하 여 잠재적인 비 옥 평가 메서드를 사용 합니다. 돌고래 소 분리 IVF 사용 하 여 중요 한 이점이 동종 IVF, 돌고래 oocytes를 얻기의 어려움 극복으로 있으며 소 oocyte 성숙 시스템 잘 테스트 체 외에서 사용을 용이 하 게. 종 특이성을 피하려면 분리 수정 ZP의 부재에서 일반적으로 수행 됩니다. Vitelline 막으로 융합 acrosome 반응 정 충의 능력의 평가 대 한 수 있습니다, 하지만 그것은 수정에 관련 된 다른 기능 평가 손상 한다. 설명 하는 절차 zona 그대로 oocytes를 사용 하 고 다음 매개 변수 평가: 정자 zona 바인딩 및 첨부 파일, 침투, polyspermy, pronuclear 형성 및 하이브리드 배아 분열.

여기, 우리가 현재 정자 컬렉션, 기본 정자 분석, 정 충 동결 뿐만 아니라 돌고래 정자 기능 평가 대 한 여러 가지 프로토콜 heterologous 체 외 수정 후 남성 pronuclear 및 하이브리드 배아 형성 평가 하 여 zona 그대로 사용 하 여 소 oocytes입니다.

Protocol

윤리 성명: 실험 절차를 모두 검토 하 고 기관 동물 관리 및 사용 Instituto Nacional de Investigación y 기술과 Agraria y 섬유 (INIA)의 위원회에 의해 승인 했다. 복제의 연구, 그리고 해양 포유 동물의 배려를 위한 동물 복지 행위는 사회에 의해 채택 모든 실험 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 가이드에 따라 수행 되었습니다. 1. 돌고래 정자 수집과 Cryopreservation 준비</stron…

Representative Results

모든 결과, 표 및 그림 (1 및 2) 여기에 제시 된 권한3으로 재현 했다. 돌핀 정 충 중지 및 재개 후 높은 운동 성을 냉동-해 동 돌고래 ejaculates 84.5 ± 5.3 총 운동 및 69.1 ± 5.1 진보적인 운동 정 충의 백분율 (% ± SD) 보여주었다. 운동 성 측면에서이 숫자는 높은-품질 cryopres…

Discussion

많은 다른 포유류 종에 대 한 동결-해 동 정자를 사용 하 여 다양 한 장점이 있다. 이 귀중 한 유전 물질, 전세계 유통에 대 한 가능성, 오염, 낮은 위험 그리고 수십 년 동안 남성 gametes를 보존 하는 기능을 전송 하는 기능을 포함 합니다. Cryopreserved의 사용이이 종 부록 II의 인용, 전송 및 다른 수 중 공원 사이 동물의 교류를 제한 하는 보호 때문에 bottlenose 돌고래에 대 한 필수적입니다. 돌고래 수송 …

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

그의 작품은 경제와 경쟁력 (AGL2015-70140-R은 D. Rizos), AGL2015-66145R A. 구 티에 레즈-아덴 및 J. F. 페 레 스-구 티에 레즈와 세네카 재단의 무르시아 (그랜트 20040/세균/16 F. 가르시아 바스 케 스에 게) 스페인 정부에 의해 투자 되었다

Materials

FERT-TALP medium Merck
TCM-199 Sigma M-4530
Hoechst 33342 Sigma B-2261
4-well dishes Nunc 176740
Density gradient BoviPure Nidacon International BP-100
Washing solution Boviwash Nidacon International BW-100
Magnesium chloride Promega A35 1H
Sterile water Mili Q sintesis A10 Millipore A35 1H
Buffer Tris Borate EDTA Sigma T4415
MB agarose Biotools 20.012
5X GoTaq flexi buffer Mili Q sintesis A10 Millipore M 890 A
MB agarose Biotools 20.012
Taq polymerase Promega
SafeView NBS Biologicals Ltd. M 890 A
Makler counting chamber Sefi Medical
Thoma chamber Hecht-Assistant
pHmeter MicropH 2000 Crison Instruments
Osmometer Advanced micro osmometer 3300 Norwood
Computer assisted sperm analysis system Projectes y Serveis R+D
Stereomicroscope MZ 95 Leica
Epifluorescent optics Eclipse Te300 Nikon
Confocal assistant 4.02 software Bio-Rad 3D analysis software
Confocal laser scanning microscopy Bio-Rad
Micropippetes (P2. P20, P200, P1000) Gilson
Microcentrifuge tubes VWR
UV iluminator Bio-Rad
PCR Thermal cycler Primus 96 Plus MWG AG Biotech

Referenzen

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Sánchez-Calabuig, M. J., García-Vázquez, F. A., Laguna-Barraza, R., Barros-García, C., García-Parraga, D., Rizos, D., Gutiérrez Adan, A., Pérez-Gutíerrez, J. F. Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization. J. Vis. Exp. (126), e55237, doi:10.3791/55237 (2017).

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