Summary

Regia di differenziazione dei progenitori ematopoietici primitivi e definitivo da cellule staminali pluripotenti umane

Published: November 01, 2017
doi:

Summary

Qui, presentiamo pluripotenti umane protocolli di coltura della cellula formativa (hPSC), utilizzata per differenziare hPSCs in CD34+ progenitori ematopoietici. Questo metodo utilizza la modifica di fase-specifici di Canonica WNT segnalazione per specificare le celle esclusivamente al programma ematopoietica sia definitiva o primitivo.

Abstract

Uno degli obiettivi principali per la medicina rigenerativa è la generazione e la manutenzione di cellule staminali ematopoietiche (HSCs) derivati da cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs). Fino a poco tempo, gli sforzi per differenziare hPSCs in HSCs hanno generato principalmente progenitori ematopoietici che mancano di potenziale HSC e invece assomigliano vitellino ematopoiesi. Questi progenitori ematopoietici risultanti potrebbero essere limitato utilità per la modellazione in vitro malattia di vari disordini ematopoietici adulti, in particolare quelli dei lignaggi linfoidi. Tuttavia, recentemente abbiamo descritto i metodi per generare progenitori ematopoietici definitivi multilineare eritro-mielo-linfoidi da hPSCs utilizzando un protocollo di differenziazione diretto fase-specifici, che descriviamo qui. Attraverso la dissociazione enzimatica di hPSCs su plasticware rivestite con matrice della membrana dello scantinato, si formano corpi embryoid (EBs). EBs si differenzino per mesoderma BMP4 ricombinante, che viene successivamente specificato al programma ematopoietico definitivo dall’inibitore GSK3β, CHIR99021. In alternativa, ematopoiesi primitivo viene specificato dall’inibitore PORCN, IWP2. Ematopoiesi è ulteriormente guidato attraverso l’aggiunta del ricombinante VEGF e citochine ematopoietiche solidale. I progenitori ematopoietici risultanti generati utilizzando il metodo hanno il potenziale per essere utilizzato per malattia e modelli inerenti allo sviluppo, in vitro.

Introduction

Cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) sono definite nel senso che comprende sia le cellule staminali embrionali umane (hESC) e cellule staminali umane pluripotenti indotte (hiPSCs) e hanno la capacità unica di non solo in fase di auto-rinnovamento in condizioni di crescita appropriata, ma anche, la capacità di differenziarsi in tutti i tipi di cellule derivate da tre strati di germe: ectoderma, mesoderma ed endoderma1. A causa di queste abilità uniche, hPSCs tenere grande promessa per la medicina rigenerativa, la modellazione di malattia e le terapie basate sulle cellule2. Mentre più tipi di cellule sono stati differenziati con successo dai hPSCs, una sfida significativa è la specifica in vitro di esclusivamente adulto-come hPSC-derivato cellule staminali ematopoietiche (HSCs) e definitivi progenitori ematopoietici.

Un probabile ostacolo allo sviluppo di HSC umane da hPSCs è la presenza di più programmi ematopoietiche entro l’ embrione umano3. Il primo programma che emerge, definito “primitivo ematopoiesi,” nasce all’interno del tessuto del sacco vitellino extraembryonic e meglio è caratterizzato dalla sua produzione transitoria di progenitori dell’eritroblasto (EryP-CFC), macrofagi e megacariociti. In particolare, questo programma non dà luogo a HSCs, né dà origine ai progenitori linfoidi T e B. Tuttavia, il sacco vitellino transitoriamente dar luogo a progenitori ematopoietici definitivi con restrizioni, come il progenitore eritro-mieloide (EMP4,5,6,7,8) e degli eritrociti-carenti linfoide-innescato multipotenti progenitrici (LMPP9). Tuttavia, EMPs né LMPPs sono completamente multipotenti, o in grado di attecchimento di HSC-come nei destinatari adulti. Al contrario, più avanti in sviluppo, il programma ematopoietico “definitivo” classicamente definito è specificato nella regione dell’aorta-gonade-Mesonefro dell’embrione propriamente detto, dando vita a tutte le filiere emopoietiche adulti, tra cui l’HSC. La specifica di queste cellule ematopoietiche definitive intra-embrionali si verifica in una tacca-dipendente, tramite una transizione endoteliali–emopoietici dal hemogenic dell’endotelio (lui)3,10,11 ,12,13,14. A parte la capacità di ricostituzione, il potenziale di multilineage e tacca-dipendenza di queste cellule può essere utilizzato per distinguere questi progenitori ematopoietici definitivi da EMP e il LMPP (rivisto in riferimenti3,13 ).

Comprendere i meccanismi che disciplinano primitivo e definitiva specifica ematopoietica da hPSCs è probabilmente fondamentale per la produzione riproducibile dei progenitori ematopoietici definitivi attraverso una varietà di linee di hPSC. Fino a poco tempo, protocolli di differenziazione hPSC che potrebbero separare multipotenti progenitori ematopoietici primitivi e definitivi non esisteva15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25. Molti approcci utilizzando siero bovino fetale (FBS) e/o stromale co-coltura prima delineato il potenziale ematopoietico di differenziazione hPSC, con miscele di primitivo e definitiva ematopoietiche potenziali15,16, 17,19,22,23,25. Ulteriormente, molti protocolli senza siero ematopoietiche sono descritti i requisiti di segnale per la specifica del mesoderma da hPSCs che continuano ad avere potenziale ematopoietico18,20,21, 24. Tuttavia, come questi metodi ancora ha dato luogo a miscele eterogenee di entrambi i programmi, il loro uso in applicazioni cliniche e comprensione dei meccanismi dello sviluppo può essere limitato.

Recentemente abbiamo costruito su questi studi, dopo aver delineato i requisiti del segnale di fase-specifici per ACTIVIN/NODAL e segnalazione di WNT nella specifica ematopoietico primitivo e definitiva dal mesoderma hPSC-derivato18,26 . Quest’ultimo era particolarmente unico, come il suo utilizzo di manipolazione del segnale WNT fase-specifici permette per la specifica di essere esclusivamente primitivo o di progenitori ematopoietici definitivo26esclusivamente. Durante la specifica di mesoderma, l’inibizione di segnalazione WNT canonico con l’inibitore PORCN IWP2 risultati nella specifica di CD43+ EryP-CFC e dei progenitori mieloidi, con nessun potenziale linfoide rilevabile. In netto contrasto, stimolazione della canonica WNT segnalazione con l’inibitore di GSK3β, CHIR99021, durante la stessa fase di differenziazione ha provocato la completa assenza di CD43 rilevabile+ EryP-CFC, mentre contemporaneamente conduceva per la specifica di CD34+CD43 HE. Questa popolazione ha posseduto mieloide, HBG-che esprimono degli eritrociti e potenziale T-linfoide. Successive analisi hanno identificato questo aveva come manca l’espressione di CD7327,28 CD18428e suo potenziale ematopoietico tacca-dipendente28. Più ulteriormente, unicellulare clonale analisi hanno dimostrato che queste filiere emopoietiche definitivi potrebbero essere derivati da cellule multipotenti singola28. Presi insieme, questi studi indicano che fase-specifici WNT segnalazione manipolazione possibile specificare puri primitivi progenitori ematopoietici, oppure multipotenti progenitori ematopoietici definitivi di NOTCH-dipendente.

Qui, descriviamo la nostra strategia di differenziazione che produce esclusivamente primitivi o definitivi progenitori ematopoietici, attraverso la manipolazione delle canoniche WNT segnalazione durante mesodermal patterning e loro a valle lineage ematopoietico saggi. Questo protocollo è di grande valore per i ricercatori che sono interessati nella produzione di progenitori ematopoietici primitivi o definitivi da hPSCs per applicazioni di medicina rigenerativa.

Protocol

1. reagenti Obtain cella linee; hESCs o hiPSCs 1, mouse fibroblasti embrionali (MEFs) 29, OP9-DL4 stroma 30 , 31. preparazione dei reagenti preparare una soluzione di 0,1% p/v di gelatina in PBS. Sterilizzare in autoclave e dopo aliquotare e conservare a 4 ° C. Preparare il plasticware rivestite con gelatina. Cappotto piatti 6 pozzetti con 1,5 mL di soluzio…

Representative Results

Un disegno schematico raffigurante l’induzione di progenitori ematopoietici primitivi e definitivi da hPSCs è illustrato nella Figura 1. Mesoderma patterning di Canonica WNT segnalazione si verifica durante i giorni 2-3 di differenziazione, seguita dalla specifica di progenitori emopoietici. L’analisi cytometric di flusso rappresentativi e saggi di metilcellulosa di culture di differenziamento emat…

Discussion

Questo protocollo descrive un metodo rapido, privo di siero, stroma-free per la differenziazione dei progenitori ematopoietici primitivi o definitivi. Mesodermal specifica dei progenitori ematopoietici primitivi o definitivi può essere raggiunto in modo affidabile utilizzando il nostro protocollo, che sfrutta in modo univoco piccole molecole inibitrici di segnalazione WNT canonico. L’attivazione di WNT fase-specifici dall’inibitore GSK3β CHIR9902133 dà luogo a definitiva mesoderma ematopoietico…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Quest’opera è stata sostenuta dal dipartimento di medicina interna, divisione di ematologia, Washington University School of Medicine. CD è stato supportato da T32HL007088 dal cuore nazionale, polmone e sangue Institute. CMS è stato supportato da una società americana di ematologia Scholar Award.

Materials

Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMD) Corning 10-016
Fetal Bovine Serum (FBS), ES cell rated Gemini Bioproducts 100-500
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30396.03
L-glutamine, 200 mM solution Life Technologies 25030-081
Penicillin-streptomycin Life Technologies 15070-063
0.25% Trypsin-EDTA Life Technologies 25200056
0.05% Trypsin-EDTA Life Technologies 25300054
Gelatin, porcine skin, Type A Sigma-Aldrich G1890
Alpha-MEM Life Technologies 12000-022
DMEM-F12 Corning 10-092-CV
Knock-out serum replacement Life Technologies 10828028 "KOSR"
Non-essential amino acids (NEAA) Life Technologies 11140050
b-mercaptoethanol, 55 mM solution Life Technologies 21985023
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich H1758
Fraction V, Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1605
Ham's F12 Corning 10-080
N2 supplement Life Technologies 17502048
B27 supplement, no vitamin A Life Technologies 12587010
Stempro-34 (SP34) Life Technologies 10639011 "SP34"
Growth factor reduced Matrigel Corning 354230 "MAT"
L-absorbic acid Sigma-Aldrich A4403
Human serum transferrin Sigma-Aldrich 10652202001
Monothioglycerol (MTG) Sigma-Aldrich M6145
Collagenase B Roche 11088831001
Collagenase II Life Technologies 17101015
DNaseI Calbiochem 260913
Phosphate Buffered Saline (PBS) Life Technologies 14190144
bFGF R&D Systems 233-FB
BMP4 R&D Systems 314-BP
Activin A R&D Systems 338-AC
VEGF R&D Systems 293-VE
SCF R&D Systems 255-SC
IGF-1 R&D Systems 291-G1
IL-3 R&D Systems 203-IL
IL-6 R&D Systems 206-IL
IL-7 R&D Systems 207-IL
IL-11 R&D Systems 218-1L
TPO R&D Systems 288-TP
EPO Peprotech 100-64
Flt-3 ligand (FLT3-L) R&D Systems 308-FK
CHIR99021 Tocris 4423
IWP2 Tocris 3533
Angiotensin II Sigma-Aldrich A9525
Losartan Potassium Tocris 3798
CD4 PerCP Cy5.5 Clone RPA-T4 BD Biosciences 560650 Dilution 1:100; T cell assay
CD8 PE Clone RPA-T8 BD Biosciences 561950 Dilution 1:10; T cell assay
CD34 APC Clone 8G12 BD Biosciences 340441 Dilution 1:100; EHT assay
CD34 PE-Cy7 Clone 8G12 BD Biosciences 348801 Dilution 1:100; Hemogenic endothelium
CD43 FITC Clone 1G10 BD Biosciences 555475 Dilution 1:10; Hemogenic endothelium
CD45 APC-Cy7 Clone 2D1 BD Biosciences 557833 Dilution 1:50; T cell assay
CD45 eFluor450 Clone 2D1 BD Biosciences 642284 Dilution 1:50; EHT assay
CD56 APC Clone B159 BD Biosciences 555518 Dilution 1:20; T cell assay
CD73 PE Clone AD2 BD Biosciences 550257 Dilution 1:50; Hemogenic endothelium
CD184 APC Clone 12G5 BD Biosciences 555976 Dilution 1:50; Hemogenic endothelium
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) BD Biosciences 564907 Dilution 1:10,000; T cell assay
OP9 DL4 cells Holmes, R. and J.C. Zuniga-Pflucker. Cold Spring Harb Protoc, 2009. 2009(2): p. pdb prot5156
MethoCult H4034 Stemcell Technologies 4034 "MeC"
Milli-Q water purification system EMD Millipore
5% CO2 incubator Set at 37 C
Multigas incubator Set at 37 C, 5% CO2, 5% O2
6 well tissue culture plate Corning 353046
24 well tissue culture plate Corning 353226
6 well low-adherence tissue culture plate Corning 3471
24 well low-adherence tissue culture plate Corning 3473
35 mm tissue culture dishes Corning 353001
Blunt-end needle, 16 gauge Corning 305198
3 cc syringes Corning 309657
5 mL polypropylene test tube Corning 352063
5 mL polystyrene test tube Corning 352058
15 mL polypropylene conical Corning 430791
50 mL polypropylene conical Corning 430921
2 mL serological pipette Corning 357507
5 mL serological pipette Corning 4487
10 mL serological pipette Corning 4488
25 mL serological pipette Corning 4489
Cell scrapers Corning 353085
2.0 mL cryovials Corning 430488
5 mL test tube with 40 µM cell strainer Corning 352235
40 µM cell strainer Corning 352340
Cell culture centrifuge
Biosafety hood
FACS AriaII or equivalent
LSRii or equivalent
FlowJo software TreeStar
Water bath Set at 37 C
0.22 µM filtration system Corning
Autoclave
4 C refrigerator
-20 C Freezer
-80 C Freezer

Referenzen

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Dege, C., Sturgeon, C. M. Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (129), e55196, doi:10.3791/55196 (2017).

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