Differenzierung der Primitive und Definitive hämatopoetischen Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotente Stammzellen gerichtet

Menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSCs) sind definiert als mit humanen embryonalen Stammzellen (HES) und menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSCs) und haben die einzigartige Fähigkeit, nicht nur in der Selbsterneuerung unter geeigneten Wachstumsbedingungen, aber auch die Fähigkeit, sich in alle Zelltypen differenzieren abgeleitet aus den drei Mikrobeschichten: Entoderm, Mesoderm und Ektoderm¹. Aufgrund dieser einzigartigen Fähigkeiten halten hPSCs große Verheißung für die regenerative Medizin, Krankheit Modellierung und zellbasierte Therapien². Während mehrere Zelltypen erfolgreich von hPSCs unterschieden wurde, ist eine große Herausforderung der in-vitro- Spezifikation ausschließlich Erwachsenen-wie hPSC hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) und definitive hämatopoetischen Vorläuferzellen.

Eine wahrscheinlich Hindernis für die Entwicklung der menschlichen HSCs aus hPSCs ist das Vorhandensein von mehreren hämatopoetischen Programmen innerhalb der menschlichen Embryos³. Das erste Programm, das entsteht, “primitive Hämatopoese,” bezeichnet, entsteht im Gewebe extraembryonic Dottersack und zeichnet sich durch seine vorübergehende Produktion von Erythroblast Vorfahren (EryP-CFC), Makrophagen und Megakaryozyten am besten. Vor allem, dieses Programm gibt keinen Anlass, HSCs, noch gibt es Anlass zu T- und B lymphoiden Vorläuferzellen. Allerdings der Dottersack vorübergehend eingeschränkt definitive hämatopoetischen Vorfahren, wie z. B. der Erythro-myeloischen Vorläuferzellen (EMP^4,5,6,7,8) hervorrufen und die erythroiden-defizienten lymphatischen grundiert multipotenten Vorläuferzellen (LMPP⁹). Jedoch sind weder EMPs noch LMPPs, voll multipotenten oder HSC-ähnliche Engraftment in Erwachsenen Empfänger in der Lage. Im Gegensatz dazu wird später in der Entwicklung, das klassisch definierte “definitive” hämatopoetische Programm im Großraum Aorta-Gonade-Wachstum des Embryos richtige, was zu allen Erwachsenen hämatopoetischen Linien, einschließlich der HSC angegeben. Die Spezifikation dieser intra embryonalen definitive hämatopoetischen Zellen tritt in einer Kerbe-abhängigen Weise über eine endotheliale-hämatopoetischen Übergang von Hemogenic Endothel (er)^{3,10,11 ,12,13,14}. Abgesehen von Rekonstitution Kapazität Multilineage potenzielle und Notch-Abhängigkeit von diesen Zellen lässt sich diese endgültige hämatopoetischen Vorläuferzellen aus der EMP und die LMPP (rezensiert in Referenzen^{3,13 unterscheiden} ).

Verständnis der Mechanismen für primitiv und definitive hämatopoetischen Spezifikation von hPSCs dürfte für die reproduzierbare Produktion von definitive hämatopoetischen Vorläuferzellen über eine Vielzahl von hPSC Linien von entscheidender Bedeutung. Bis vor kurzem existierten hPSC Differenzierung Protokolle, die multipotente primitive und definitive hämatopoetische Vorläuferzellen trennen konnte nicht^{15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25}. Viele Ansätze mit fetalen bovine Serum (FBS) und/oder Stromazellen Kokultur zuerst umrissen der hämatopoetische Potenzial der hPSC Differenzierung, mit einer Mischung aus primitiven und endgültige hämatopoetischen potenzielle^{15,16, 17,19,22,23,25}. Weitere, viele serumfreien hämatopoetischen Protokolle haben die Signal-Anforderungen für die Spezifikation von Mesoderm aus hPSCs, die blutbildenden potenzielle^18,20,21, birgt beschrieben ²⁴. wie diese Methoden noch heterogene Mischungen beider Programme hervorbrachte, deren Einsatz in klinische Anwendungen und Entwicklungsmechanismen Verständnis kann jedoch begrenzt.

Wir haben vor kurzem auf diesen Studien aufgebaut haben skizziert die Bühne-spezifische Signal Anforderungen an ACTIVIN/NODAL und WNT signalisieren in primitive und endgültige hämatopoetischen Spezifikation vom hPSC abgeleitet Mesoderm^18,26 . Letzteres war besonders einzigartig, da die Nutzung der Bühne-spezifische WNT Signalmanipulation für die Spezifikation von ausschließlich primitiv oder ausschließlich endgültige hämatopoetischen Vorläuferzellen²⁶ermöglicht. Während Mesoderm-Spezifikation, die Hemmung der kanonischen WNT signalisieren mit dem PORCN-Inhibitor IWP2 führt bei der Spezifikation von CD43⁺ EryP-CFC und myeloischer Vorläuferzellen mit kein nachweisbar lymphoide Potenzial. In scharfem Kontrast, Stimulation der kanonischen WNT-Signal mit dem GSK3β-Inhibitor, CHIR99021, in der gleichen Phase der Differenzierung führte in die völlige Abwesenheit von nachweisbaren CD43⁺ EryP-CFC, während gleichzeitig führt zu den Spezifikation der CD34⁺CD43⁻ HE. Diese Bevölkerung besaß myeloische, HBG-erythroiden und T-lymphatischen Potenzial zum Ausdruck bringt. Spätere Analysen identifiziert, das er als Ausdruck CD73^27,28 und CD184²⁸und sein hämatopoetischen Potential fehlt Kerbe-abhängige²⁸war. Weitere, einzellige klonale Analysen gezeigt, dass diese endgültige hämatopoetischen Linien von multipotenten Einzelzellen²⁸abgeleitet werden können. Zusammen genommen, zeigen diese Studien, dass die Bühne-spezifische WNT signalisieren Manipulation pur primitive hämatopoetischen Vorläuferzellen oder multipotenten Kerbe-abhängige definitive hämatopoetischen Vorläuferzellen angeben kann.

Hier beschreiben wir unsere Differenzierungsstrategie, die ausschließlich primitive oder endgültige hämatopoetischen Stammväter, durch Manipulation der kanonischen WNT signalisieren während mesodermalen Musterung und ihre nachgelagerten hämatopoetischen Linie Assays ergibt. Dieses Protokoll ist von großem Wert für die Ermittler, die die Produktion von entweder primitiv oder endgültige hämatopoetischen Vorläuferzellen aus hPSCs für regenerative Medizin Anwendungen interessiert sind.