Summary

Herstellung und Verabreichung von therapeutischen mesenchymalen Stamm- / Stroma-Zellen (MSC) Sphäroiden Primed in 3-D-Kulturen unter Xeno freien Bedingungen

Published: March 18, 2017
doi:

Summary

The therapeutic potential of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) is well-documented, however the best method of preparing the cells for patients remains controversial. Herein, we communicate protocols to efficiently generate and administer therapeutic spherical aggregates or ‘spheroids’ of MSCs primed under xeno-free conditions for experimental and clinical applications.

Abstract

Mesenchymale Stammzellen / Stromazellen (MSCs) vielversprechend in der Biotechnik und der regenerativen Medizin. MSCs können aus mehreren adulten Geweben durch ihre starke Adhärenz an Gewebekulturkunststoff und dann expandiert weiter in vitro isoliert werden, am häufigsten fötalem Rinderserum (FBS) verwendet wird . Da FBS können MSCs verursachen immunogen zu werden, begrenzt seine Präsenz in MSC-Kulturen sowohl klinische und experimentelle Anwendungen der Zellen. Daher unter Verwendung von Studien chemisch definierte Xeno-freie (XF) Medien für die MSC-Kulturen sind äußerst wertvoll. Viele vorteilhafte Wirkungen von MSCs wurden auf ihre Fähigkeit zurückzuführen Entzündung und Immunität zu regeln, vor allem durch die Sekretion von immunmodulatorische Faktoren wie Tumor-Nekrose-Faktor-stimulierte Gen 6 (TSG6) und Prostaglandin E2 (PGE2). Jedoch erfordern MSCs Aktivierung dieser Faktoren zu erzeugen, und da die Wirkung von MSCs oft vergänglich ist, hat großes Interesse hervor Wege der Pre-Aktivierung der Zellen Prio zu entdeckenr ihre Verwendung, wodurch die Beseitigung der Verzögerungszeit für die Aktivierung in vivo. Hier präsentieren wir Protokolle effizient aktivieren oder prime MSCs in dreidimensionalen (3D) Kulturen unter chemisch XF Bedingungen definiert und diese voraktivierten MSCs in vivo zu verabreichen. Insbesondere wir zuerst beschreiben Verfahren zur sphärischen MSC Mikrogeweben oder "Sphäroide" in hängenden Tropfen unter Verwendung XF Medium erzeugen und zu zeigen, wie die Kugeln und konditioniertes Medium (CM) können für verschiedene Anwendungen geerntet werden. Zweitens beschreiben wir die Genexpression Bildschirme und in vitro funktionelle Assays , um schnell das Niveau der MSC Aktivierung in Sphäroide bewerten, die entzündungshemmende und Anti-Krebs – Potential der Zellen zu betonen. Drittens beschreiben wir ein neues Verfahren intakte MSC Sphäroide in die Maus – Peritonealhöhle für in vivo Wirksamkeitstests zu injizieren. Insgesamt überwinden die Protokolle hier großen Herausforderungen unter chemisch definierten XF con voraktivierten MSCs zu erhaltenBedingungen und bieten ein flexibles System MSC Sphäroiden für Therapien zu verabreichen.

Introduction

Mesenchymale Stammzellen / Stromazellen (MSCs) sind für verschiedene regenerative Medizin Ansätze großes Potenzial gezeigt. MSCs wurden zunächst als stromal Komponente von Knochenmark isoliert wurden , da aber von zahlreichen anderen adulten Geweben erhalten worden sind , einschließlich Fettgewebe 1, 2, 3. Interessanterweise umfasst der Hauptisolationsverfahren die bemerkenswerte Eigenschaft von MSCs fest auf Gewebekulturkunststoff in Gegenwart von fötalem Rinderserum (FBS) zu haften. Während dieses traditionelle Isolationstechnik eine einfache und schnelle Expansion von MSCs ermöglicht in zweidimensionalen (2D) Kultur, ist es auch sehr künstlich und mißachtet Bedeutung der nativen dreidimensionalen (3D) Umgebung zu möglichen Verlust von wichtigen zellulären Eigenschaften führende 4, 5 , 6. Daher ist die Untersuchung von MSCs in 3D-Kulturen, diesind physiologische als herkömmliche 2D-Kulturen, hat für "verloren / verminderte" MSC Merkmale auf der Suche entstanden. Xeno-frei (XF) chemisch definierte Bedingungen für die MSC Kultur und Aktivierung, zu identifizieren und somit machen die Zellen besser geeignet für klinische Anwendungen Zudem hat großes Interesse gestiegen.

Viele Studien sind veröffentlicht worden, die 3D-Kultur von MSCs zeigen sowohl in Biomaterialien und als sphärische Aggregate oder Sphäroide. MSCs in Biomaterialien wurden zunächst für das Tissue Engineering Ansätze entwickelt , beschädigte Gewebe mit Zell ausgesät Gerüste zu ersetzen, während Sphäroid – Kulturen von MSCs als eine Möglichkeit gesehen wurden MSC Verhalten in vivo nach der Verabreichung der Zellen für Therapien in präklinischen oder klinischen Studien zu verstehen , 4, 5, 7. Interessanterweise spontan Sphäroiden MSCs bilden sich, wenn die Einhaltung der Gewebekultur-Plastik ist nicht zulässig8, 9, 10. Traditionell wurde die Zellaggregation durch Rührflasche Methoden oder flüssigen Overlay-Techniken erleichtert, Methoden zunächst in der Krebsbiologie bei den Bemühungen um zu versuchen, den Tumor-Mikroumgebung zu imitieren. In jüngerer Zeit wurden weitere Methoden taucht , die Zellaggregation in Kulturschalen vorbeschichtet mit spezifischen Chemikalien zeigen zu verhindern Zelle zu Kunststoffhaft 4, 5, 6. Eine der einfachsten und wirtschaftlichsten Verfahren MSC Sphäroide zu erzeugen, ist zur Kultur sie in hängenden Tropfen, eine Technik, die häufig verwendet wurde embryoid bodies aus embryonalen Stammzellen zu erzeugen. Mit hängenden Tropfen Kulturtechnik, die Zellhaftung an den Gewebekulturkunststoff wird durch Suspendieren der Zellen in einem Tropfen des Mediums auf der Unterseite einer Gewebekulturschale Deckel verhindert und damit die Schwerkraft zu erleichtern Zelle AGGREGation in der Spitze des Tropfens. Das Sphäroid Größe kann leicht durch Ändern der Zellkonzentration oder das Tropfenvolumen manipuliert werden, Tropfen Kulturen machen hanging besonders einfach zu steuern.

Frühe Untersuchungen über die 3D – Kultur von MSCs gezeigt radikalen Unterschiede in den Eigenschaften der Zellen in 3D im Vergleich zu ihren Pendants 2D 6, 8, 9. Zur gleichen Zeit zeigten Berichte , dass die vorteilhaften Wirkungen von MSCs in vivo auf ihre Fähigkeit , durch Mikroumweltreize aktiviert zu werden , verlassen und in Reaktion darauf zu erzeugen , entzündungshemmende und immunmodulierende 11 Faktoren. Interessanterweise viele dieser Faktoren wie Prostaglandin E2 (PGE2), Tumor-Nekrose-Faktor-stimulierte Gen 6 (TSG6) und Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF) wurde in viel größeren Mengen von MSC Sphäroide als herkömmliche 2D MSCs ebnet den Weg für das produzierte Idee vonVerwendung von 3D – Kulturen , die Zellen 8, 12, 13 zu aktivieren. Außerdem Genaktivierung in 3D Kulturen erschienen Mechanismen zu rekapitulieren, zumindest teilweise der Zellaktivierung nach Injektion in 12 Mäusen. Durch die in den Experimenten MSCs vor ihrer Verwendung zu aktivieren, Auswirkungen der Zellen verlängert werden könnte , und mehr im Vordergrund als die traditionelle MSC Wirkung in vivo oft verzögert und vorübergehend, und kann als "Hit and Run" beschrieben werden. In den letzten Jahren wichtige funktionelle Studien MSC Sphäroide verwenden , haben gezeigt , dass sie Entzündungsreaktionen zu unterdrücken und zu modulieren Immunität in vivo durch Effektorzellen , wie beispielsweise Makrophagen, dendritischen Zellen zu beeinflussen, Neutrophile und T – Zellen Sphäroide eine attraktive Form grundierte MSCs 2 Herstellung , 3. Zusätzlich Herstellung von Anti-Krebs-Moleküle, wie interleukin-24 (IL-24) und Tumor – Nekrose – Faktor-verwandten Apoptose-induzierenden Liganden (TRAIL), werden in 3D – Kulturen von MSCs relativ erhöht MSCs zu Monoschicht ein Phänomen , das für die gezielte Krebstherapien 8, 10, 14 ausgenutzt werden könnte.

Da die traditionelle MSC Kultur nicht nur die Verwendung von Gewebekulturkunststoff erforderlich, sondern auch FBS, auf eine weitere Hürde zugänglich MSC Sphäroiden mehr machen für die klinische Anwendung zu überwinden hatte. Um diese Hürde bewältigen, wir die Bildung von Sphäroiden MSC unter bestimmten Bedingungen chemisch definierten XF kürzlich gezeigt und festgestellt , dass die resultierenden MSC Sphäroide wurden die gleichen entzündungshemmenden und anti-Krebs – Moleküle , wie die Sphäroide in Bedingungen mit 14 FBS erzeugt herzustellen aktiviert. Hier werden diese Erkenntnisse in mehreren ausführlichen Protokolle vorgestellt, die die Erzeugung von voraktivierten MSCs in 3D-Kulturen unter Verwendung von XF zeigenMedien. Außerdem werden Protokolle vorgestellt, die effektivsten Möglichkeiten, beschreiben die Aktivierungsstufen der MSCs in Bezug auf ihre entzündungshemmende, immunmodulierende und Anti-Krebs-Wirkung, zusammen mit einem praktischen Verfahren zur Beurteilung der intakten Sphäroiden in Mäuse zu liefern.

Protocol

1. MSC Isolierung und Expansion Erhalten frühen Passage MSCs von Zentrum für die Vorbereitung und Verteilung von adulten Stammzellen ( http://medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html ) 15 als gefrorene Fläschchen. Alternativ isolieren MSCs aus Aspiraten Knochenmark eine Routine – Protokoll nach dem 14. und speichern , wie gefrorene Fläschchen. Bereiten komplette…

Representative Results

In der aktuellen Arbeit wurden hängenden Tropfen Kulturen unter XF Bedingungen kompakten sphärischen Mikrogeweben oder "Sphäroiden" von aktivierten MSCs zu erzeugen. Die Prüfpräparate Roadmap in 1 veranschaulicht , dass MSCs zur Selbstorganisation gefördert werden in Sphäroide wenn in hängenden Tropfen für 72 Stunden ausgesetzt, wonach die Sphäroide oder das CM mit Kugel abgeleiteten therapeutischen Faktoren geladen wird , kann sowohl gesammelt und m?…

Discussion

Die optimale MSC für die Verwendung in einigen Forschung und klinische Anwendungen sollten hoch aktivierten ihren Nutzen zu maximieren, und vorzugsweise unter chemisch definierten XF Bedingungen hergestellt, die Lieferung von potentiellen Antigenen aus xenogenen Mediumkomponenten wie FBS zu minimieren. In den Protokollen hier beschrieben, haben wir Methoden 1 gezeigt) aktivieren MSCs in 3D Kultur durch Bildung von Sphäroiden, 2) erreichen, um die 3D-Aktivierung von MSCs unter Bedingungen XF, 3) Auswertung der Aktivier…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was funded in part by grant P40RR17447 from the National Institute of Health and award RP150637 from the Cancer Prevention and Research Institute of Texas. We would like to thank Dr. Darwin J. Prockop for his support on the project.

Materials

MEM-α (minimal essential medium alpha) ThermoFisher/Gibco 12561049; 12561056; 12561072 minimal essential medium for preparation of MSC growth medium (CCM)
FBS (fetal bovine serum), premium select Atlanta Biologicals S11595; S11510; S11550; S11595-24 component of complete culture media for all types of cells
L-glutamine ThermoFisher/Gibco 25030081; 25030149; 25030164 component of complete culture media for all types of cells
Penicillin/Streptomycin ThermoFisher/Gibco 15070063 component of complete culture media for all types of cells
Sterilization Filter Units, 0.22 µm PES membrane MilliporeSigma SCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; SCGPU11RE media sterilization
150 mm cell culture dish Nunc D8554 SIGMA cell culture
Thermo Forma water-jacketed CO2 humidified incubator Thermo Fisher Model 3110 incubation of cultured cells
Early passage MCSs Center for the preparation and Distribution of Adult Stem Cells at The Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & White NA preparation of 2D and 3D cultures of MSCs
water bath VWR 89501-468 warming media to 37 °C
Pipettes Eppendorf 492000904 manual liquid handling
Pipete-Aid Drummond Scientific Company 4-000-300 handling sereological pipetes
Costar sterile serological pipet (5, 10, 25 and 50 ml) Corning 4487; 4101; 4251; 4490 liquid handling
PBS (phosphate buffered saline), pH 7.4 ThermoFisher/Gibco 10010023; 10010072; 10010031; 10010049 cell culture processing
0.25% trypsin/EDTA solution ThermoFisher/Gibco 25200056; 25200072; 25200114 lifting adherent cells and dispersing cell aggregates
15 ml conical tube Corning/BD Falcon 352097 cell centrifugation
50 ml conical tube Corning/BD Falcon 352098 cell centrifugation
Eppendor refrigerated centrifuge Eppendorf/Fisher Scientific Model 5810R cell centrifugation
hemocytometer Fisher Scientific 26716 cell counting
trypan blue Sigma-Aldrich T8154 SIGMA dead cell exclusion during cell counting in hemacytometer
Defined xenofree MSC medium-1 (XFM-1) ThermoFisher/Gibco A1067501 Xeno-free media specifically formulated for the growth and expansion of human mesenchymal stem cells
Defined xenofree MSC medium-2 (XFM-2) Stem Cell Technologies 5420 Defined, xeno-free medium for human mesenchymal stem cells
HSA (Human serum albumin) Gemini 800-120 Component of xeno-free MSC media
rHSA (recombinant Human serum albumin) Sigma-Aldrich A9731 SIGMA Component of xeno-free MSC media
8-channel pipette, 10 – 100 µL Eppendorf 022453904 preparation of hanging drops
Total RNA isolation Mini Kit Qiagen 74104 Total RNA extraction
Qiashredder Qiagen 79654 Sample homogenization prior to total RNA extraction
RNAse-free DNase Set  Qiagen 79254 On-column DNA elimination during total RNA extraction
β-mercaptoethanol  Sigma-Aldrich M6250 ALDRICH inhibition of RNAses in RLT buffer
Vortex VWR 97043-562 mixing sample
Spectrophotometer Biorad NA RNA concentration and quality
High capacity cDNA Reverse Transcription Kit ThermoFisher/Applied Biosystems 4368814 transcription of total RNA into cDNA
Gene Expression Assays ThermoFisher/Applied Biosystems varies primer/probe combination for real-time PCR
Fast Universal PCR Master Mix ThermoFisher/Applied Biosystems 4352042; 4364103; 4366073; 4367846 master mix for real-time PCR reaction
Real-time PCR system (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System) ABI Prizm NA real-time PCR
1.5 ml centrifuge tube Eppendorf 22364111 cell centrifugation, sample collection and storage
(-80°C) freezer Thermo Fisher Model Thermo Forma 8695 sample storage
PGE2 (Prostaglandin E2) ELISA Kit R&D Systems KGE004B estimation of cytokine concentration in the sample
DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium) ThermoFisher/Gibco 10566-016; 10566-024;10566-032 macrophage culture media
J774 mouse macrophages ATCC TIB-67 mouse macrophage cell line
12-well plate Corning 3513 in-vitro macrophage stimulation
LPS (lipopolysaccharide) Sigma-aldrich L4130 in vitro macrophage stimulation
Mouse TNF-a ELISA kit R&D Systems MTA00B estimation of cytokine concentration in the sample
Mouse IL-10 (interleukin 10) ELISA kit R&D Systems M1000B estimation of cytokine concentration in the sample
RPMI-1640 medium ThermoFisher/Gibco 11875-085 splenocyte culture media
BALB/c mice The Jackson Laboratory 651 in vivo spheroid delivery; splenocyte preparation
Anti-Mouse CD3e Functional Grade Purified eBioscience 145-2C11 In vitro splenocyte stimulation
70 μm strainer  Corning 352350 Splenocyte preparation
Red blood cell lysis solution (1x) Affymetrix eBioscience 00-4333 removal of red blood cells during splenocyte isolation
Mouse IFN-y (interferon gamma) ELISA kit R&D Systems MIF 00 estimation of cytokine concentration in the sample
LNCaP prostate cancer cells  ATCC CRL-1740 study the effect of 3D MSCs on cancer cell lines in vitro
DNA-based cell proliferation assay kit ThermoFisher C7026 cell number measurement based on DNA content
NaCl Sigma-Aldrich S5150 component of lysis reagent
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) ThermoFisher FERR1021 calcium chelator, component of lysis reagent
Rnase A Qiagen 19101 RNA degradation for measurement of DNA
Filter-based multi-mode microplate reader BMG Technology NA Microplate assays (ELISA, cell quantification, e.t.c.)
HBSS (Hanks balanced salt solution), no calcium, no magnesium, no phenol red ThermoFisher/Gibco 14175079 resupsension of MSC spheroids prior to in vivo injections
Isoflurane MWI Vet Supply 502017 Anesthesia for in vivo injections
Oxygen, compressed gas Praxair NA For use with isoflurane
Thermo Forma BSL-2 cabinet Thermo Fisher Model 1385 Sterile cell culture
Safety I.V. catheter/needle stiletto, 20G, 1 inch Terumo SR*FNP2025 Delivery of shperoids into peritoneal cavity
Sterile micropipette tips Eppendorf varies liquid/cells handling

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Diesen Artikel zitieren
Ylostalo, J. H., Bazhanov, N., Mohammadipoor, A., Bartosh, T. J. Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell (MSC) Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions. J. Vis. Exp. (121), e55126, doi:10.3791/55126 (2017).

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