Xeno-ücretsiz Koşullarda 3-D Kültürler Üretim ve Tedavi Mezenkimal Kök Yönetim / Stromal Cell (MSC) küremsi Astarlı
Summary
The therapeutic potential of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) is well-documented, however the best method of preparing the cells for patients remains controversial. Herein, we communicate protocols to efficiently generate and administer therapeutic spherical aggregates or ‘spheroids’ of MSCs primed under xeno-free conditions for experimental and clinical applications.
Abstract
Mezenkimal kök / stromal hücreler (MKH) Biyomühendislik ve rejeneratif tıpta büyük umutlar tutun. MSC'ler doku kültür plastik güçlü yapışması ile birden fazla yetişkin dokulardan izole edildi ve daha sonra en sık fetal sığır serumu (FBS) ile, in vitro olarak genişletilebilir. FBS MKH'ler immünojenik hale gelmesine neden olabilir beri, MSC kültürlerde varlığını hücrelerin hem klinik hem de deneysel uygulamalar sınırlar. MSC kültürleri Bu nedenle, çalışmalar kimyasal olarak tanımlanmış istihdamı xeno-free (XF) medya son derece değerlidir. MSC yararlı etkilerinin büyük bir tümör nekroz faktörü ile uyarılan gen 6 (TSG6) ve prostaglandin E2 (PGE2) gibi başlıca bağışıklık faktörlerin salgılanması sayesinde, inflamasyon ve bağışıklık düzenleme kabiliyetleri bağlanmıştır. Ancak, MKH bu faktörlerin üretmek için aktivasyon gerektirir ve MKH etkisi genellikle geçicidir, çünkü büyük ilgi hücreleri Prio öncesi aktive yollarını keşfetmek için ortaya çıkmıştırkullanımlarına R, ve böylece in vivo olarak aktivasyon için gecikme süresini ortadan kaldırır. Burada üç boyutlu (3D) kültürlerde etkili bir şekilde harekete geçirmek için protokoller ya da asal MKH'lerin sunuyoruz kimyasal olarak tanımlanmış XF koşullar altında ve in vivo bu ön-aktifleştirilmiş MKH'lerin uygulanması. Özellikle, ilk XF orta kullanarak küresel MSC mikro dokuları veya asılı damla 'parçacıklarının' oluşturmak ve küreler ve klimalı ortam (CM) çeşitli uygulamalar için hasat edilebilir göstermek için yöntemler açıklanmaktadır. İkinci olarak, gen ekspresyon ekranlarını tarif ve in vitro fonksiyonel deneyleri, hızlı hücre anti-enflamatuar ve anti-kanser potansiyeli vurgulayan parçacıklarının MSC aktivasyon seviyesini değerlendirmek. Üçüncü olarak, in vivo etkinliği test etmek için, fare periton boşluğuna sağlam MSC sferoidler enjekte etmek için yeni bir yöntem açıklanmaktadır. Genel olarak, protokoller burada kimyasal olarak tanımlanmış XF con altında önceden etkinleştirilmiş MKH'lerin elde büyük zorlukların üstesindenkoşullarına ve tedaviler için MSC parçacıklarının yönetmek için esnek bir sistem sağlamak.
Introduction
Mezenkimal kök / stromal hücreler (MKH), çeşitli rejeneratif tıp yaklaşımları için büyük bir potansiyel göstermiştir. MSC'ler, başlangıçta, kemik iliği stromal bileşeni olarak izole edildi, ancak bu yana adipoz doku 1, 2, 3 dahil olmak üzere, pek çok diğer yetişkin dokulardan elde edilmiştir. İlginç bir şekilde, temel izolasyon yöntemi MSC gibi önemli bir özelliğe fetal sığır serumu (FBS) varlığında doku kültürü plastik üzerine sıkı bir şekilde yapışmasına içine alır. Bu geleneksel izolasyon tekniği iki boyutlu (2D) kültüründe MKH kolay ve hızlı genişlemesine izin veren iken, 5, aynı zamanda çok yapay ve önemli hücresel özellikleri 4 potansiyel kaybına yol açan doğal üç boyutlu (3D) çevrenin önemini göz ardı 6. Bu nedenle, 3D kültürlerde MSC çalışma, buradageleneksel 2B kültürlerin daha fizyolojik olan "kayıp / azalmış" MSC özellikleri arayışında ortaya çıkmıştır. Ayrıca, büyük ilgi klinik uygulamalar için hücreler daha müsait hale böylece MSC kültür ve aktivasyonu için xeno-free (XF) kimyasal olarak tanımlanmış koşulları tanımlamak ve yükseldi.
Birçok çalışma biyomalzeme ve küresel agrega ya da küresel cisimler hem MKH 3D kültürünü gösteren yayınlanmıştır. MKH sfero kültürleri klinik öncesi veya klinik çalışmalarda tedaviler için hücrelerin uygulanmasından sonra in vivo MSC davranışlarını anlamak için bir yol olarak görüldü oysa biyomalzeme MKH başlangıçta, hücre numaralı seribaşı iskeleleri ile hasarlı dokuların yerine doku mühendisliği yaklaşımları için tasarlanmış 4, 5, 7. İlginçtir, MKH formu sferoidler kendiliğinden doku kültürü plastik bağlılık izin verilmez zaman8, 9, 10. Geleneksel olarak, hücre birikme Spinner şişesi yöntemleri ya da sıvı kaplama teknikleri, tümör mikro taklit deneyin çabalarında Kanser biyolojisinde başlangıç olarak kullanılan yöntemler ile kolaylaştırıldı. Daha yakın zamanda, ilave yöntemler kültür tabaklarına hücre toplanması hücre-plastik yapışma 4, 5, 6 önlemek için özel kimyasallar ile önceden kaplanmış göstermektedir ki ortaya çıktı. MSC sferoidler oluşturmak için en basit ve en ucuz yöntemlerden biri, genellikle, embriyonik kök hücreleri embriyoid organları üretmek için kullanılan bir teknik, asılı damla kültür bunların etmektir. damla kültürü tekniği asılı olan, doku kültürü plastik hücre yapışması, hücre aggreg kolaylaştırmak için yerçekimi, bir doku kültürü kabı kapağının altında ortamının bir drop içinde süspansiyona ettirilip engellenirdamla tepesinde yer tirme. sfero boyutu kolayca, hücre konsantrasyonunu veya açılan hacmini değiştirerek kontrol etmek son derece kolay asılı damla kültürleri yaparak manipüle edilebilir.
MKH 3D kültürü üzerindeki ilk çalışmalar onların 2B meslektaşları 6, 8, 9 ile karşılaştırıldığında 3D hücrelerin özelliklerinde radikal farklılıklar göstermiştir. Aynı zamanda, in vivo koşullarında raporlar MSC yararlı etkileri, yanıt olarak, mikro çevre hareketlerine göre aktive olma, anti-enflamatuar ve bağışıklık düzenleyici olarak 11 üretme yetenekleri dayanıyordu olduğunu göstermiştir. İlginç bir şekilde, prostaglandin E2 (PGE2), tümör nekroz faktörü ile uyarılan gen 6 (TSG6), hepatosit büyüme faktörü (HGF) ve bu faktörlerin bir çok yol açan geleneksel 2D MSC daha MSC sferoidler göre çok daha büyük miktarlarda üretilmiştir fikrihücreler 8, 12, 13 aktif hale getirmek için 3D kültürleri kullanılmıştır. Ayrıca, 3D kültürlerinde gen aktivasyon fareler 12 içine enjeksiyondan sonra hücre aktivasyonunun, en azından kısmen, mekanizmaları özetlemek ortaya çıktı. In vivo geleneksel MSC etkisi genellikle gecikmeli ve geçici ve "vurmak ve koşmak" olarak tarif edilebilir gibi deneylerde bunların kullanımdan önce MKH'lerin aktive ederek, hücrelerin etkileri uzun süreli ve daha belirgin olabilir. Geçtiğimiz birkaç yıl boyunca, MSC küremsilerin kullanılması önemli fonksiyonel çalışmalar, bunların enflamatuar cevapları bastırma ve sferoidler hazırlanmış MSC 2 çekici formu hale makrofajlar, dendritik hücreler, nötrofiller ve T hücreleri gibi efektör hücrelerin etkileyerek, in vivo olarak bağışıklık modüle olduğunu göstermiştir 3. Buna ek olarak, int anti-kanser moleküllerinin üretimierleukin-24 (IL-24) ve tümör nekroz faktörü ile ilgili apoptoz-indükleyici ligand (TRAIL), erişkin mono tabakasına MSC'ler nisbetle 3D kültürlerinde hedeflenen kanser tedavileri 8, 10, 14 için yararlanılabilir bir olgu artar.
Geleneksel MSC kültür doku kültürü plastik değil, aynı zamanda FBS kullanımı sadece gerektiği gibi klinik kullanımı aşılması gereken vardı, başka bir engel MSC sferoidler daha müsait hale getirmek için. Bu engel üstesinden gelmek için, son zamanlarda, belirli kimyasal olarak tanımlanmış XF koşulları altında MSC parçacıklarının oluşumunu göstermiştir ve elde edilen MSC sferoidler FBS 14 koşullarda üretilen parçacıklarının aynı anti-enflamatuar ve anti-kanser molekülleri üretmek üzere aktive edilmiştir saptamıştır. Burada, bu bulgular XF kullanarak 3D kültürlerde önceden aktive MKH nesil gösteren birçok ayrıntılı protokoller sunulmuşturOrtam. Buna ek olarak, protokoller birlikte farelere sağlam sferoidler sunmak için pratik bir yöntem ile, anti-enflamatuar, bağışıklık düzenleyici ve anti-kanser etkilerine açısından MSC aktivasyon seviyelerini değerlendirmek için etkili yollar tarif eden sunulmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bazı araştırmalar ve klinik uygulamalarda kullanım için uygun MSC çok onların yarar en üst düzeye çıkarmak için aktif, ve tercihen FBS olarak ksenogeneik ortam bileşenlerinden potansiyel antigenlerin gönderimini en aza indirmek için, kimyasal olarak tanımlanmış XF koşullar altında hazırlanmalıdır. Burada anlatılan protokollerin olarak,: 1) için yöntemler göstermiştir parçacıklarının oluşumuyla 3D kültür MKH'lerin aktive 2) XF koşullar altında MSC 3D aktivasyonuna ulaşırlar, 3) …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded in part by grant P40RR17447 from the National Institute of Health and award RP150637 from the Cancer Prevention and Research Institute of Texas. We would like to thank Dr. Darwin J. Prockop for his support on the project.
Materials
| MEM-α (minimal essential medium alpha) | ThermoFisher/Gibco | 12561049; 12561056; 12561072 | minimal essential medium for preparation of MSC growth medium (CCM) |
| FBS (fetal bovine serum), premium select | Atlanta Biologicals | S11595; S11510; S11550; S11595-24 | component of complete culture media for all types of cells |
| L-glutamine | ThermoFisher/Gibco | 25030081; 25030149; 25030164 | component of complete culture media for all types of cells |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher/Gibco | 15070063 | component of complete culture media for all types of cells |
| Sterilization Filter Units, 0.22 µm PES membrane | MilliporeSigma | SCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; SCGPU11RE | media sterilization |
| 150 mm cell culture dish | Nunc | D8554 SIGMA | cell culture |
| Thermo Forma water-jacketed CO2 humidified incubator | Thermo Fisher | Model 3110 | incubation of cultured cells |
| Early passage MCSs | Center for the preparation and Distribution of Adult Stem Cells at The Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & White | NA | preparation of 2D and 3D cultures of MSCs |
| water bath | VWR | 89501-468 | warming media to 37 °C |
| Pipettes | Eppendorf | 492000904 | manual liquid handling |
| Pipete-Aid | Drummond Scientific Company | 4-000-300 | handling sereological pipetes |
| Costar sterile serological pipet (5, 10, 25 and 50 ml) | Corning | 4487; 4101; 4251; 4490 | liquid handling |
| PBS (phosphate buffered saline), pH 7.4 | ThermoFisher/Gibco | 10010023; 10010072; 10010031; 10010049 | cell culture processing |
| 0.25% trypsin/EDTA solution | ThermoFisher/Gibco | 25200056; 25200072; 25200114 | lifting adherent cells and dispersing cell aggregates |
| 15 ml conical tube | Corning/BD Falcon | 352097 | cell centrifugation |
| 50 ml conical tube | Corning/BD Falcon | 352098 | cell centrifugation |
| Eppendor refrigerated centrifuge | Eppendorf/Fisher Scientific | Model 5810R | cell centrifugation |
| hemocytometer | Fisher Scientific | 26716 | cell counting |
| trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 SIGMA | dead cell exclusion during cell counting in hemacytometer |
| Defined xenofree MSC medium-1 (XFM-1) | ThermoFisher/Gibco | A1067501 | Xeno-free media specifically formulated for the growth and expansion of human mesenchymal stem cells |
| Defined xenofree MSC medium-2 (XFM-2) | Stem Cell Technologies | 5420 | Defined, xeno-free medium for human mesenchymal stem cells |
| HSA (Human serum albumin) | Gemini | 800-120 | Component of xeno-free MSC media |
| rHSA (recombinant Human serum albumin) | Sigma-Aldrich | A9731 SIGMA | Component of xeno-free MSC media |
| 8-channel pipette, 10 – 100 µL | Eppendorf | 022453904 | preparation of hanging drops |
| Total RNA isolation Mini Kit | Qiagen | 74104 | Total RNA extraction |
| Qiashredder | Qiagen | 79654 | Sample homogenization prior to total RNA extraction |
| RNAse-free DNase Set | Qiagen | 79254 | On-column DNA elimination during total RNA extraction |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 ALDRICH | inhibition of RNAses in RLT buffer |
| Vortex | VWR | 97043-562 | mixing sample |
| Spectrophotometer | Biorad | NA | RNA concentration and quality |
| High capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher/Applied Biosystems | 4368814 | transcription of total RNA into cDNA |
| Gene Expression Assays | ThermoFisher/Applied Biosystems | varies | primer/probe combination for real-time PCR |
| Fast Universal PCR Master Mix | ThermoFisher/Applied Biosystems | 4352042; 4364103; 4366073; 4367846 | master mix for real-time PCR reaction |
| Real-time PCR system (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System) | ABI Prizm | NA | real-time PCR |
| 1.5 ml centrifuge tube | Eppendorf | 22364111 | cell centrifugation, sample collection and storage |
| (-80°C) freezer | Thermo Fisher | Model Thermo Forma 8695 | sample storage |
| PGE2 (Prostaglandin E2) ELISA Kit | R&D Systems | KGE004B | estimation of cytokine concentration in the sample |
| DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium) | ThermoFisher/Gibco | 10566-016; 10566-024;10566-032 | macrophage culture media |
| J774 mouse macrophages | ATCC | TIB-67 | mouse macrophage cell line |
| 12-well plate | Corning | 3513 | in-vitro macrophage stimulation |
| LPS (lipopolysaccharide) | Sigma-aldrich | L4130 | in vitro macrophage stimulation |
| Mouse TNF-a ELISA kit | R&D Systems | MTA00B | estimation of cytokine concentration in the sample |
| Mouse IL-10 (interleukin 10) ELISA kit | R&D Systems | M1000B | estimation of cytokine concentration in the sample |
| RPMI-1640 medium | ThermoFisher/Gibco | 11875-085 | splenocyte culture media |
| BALB/c mice | The Jackson Laboratory | 651 | in vivo spheroid delivery; splenocyte preparation |
| Anti-Mouse CD3e Functional Grade Purified | eBioscience | 145-2C11 | In vitro splenocyte stimulation |
| 70 μm strainer | Corning | 352350 | Splenocyte preparation |
| Red blood cell lysis solution (1x) | Affymetrix eBioscience | 00-4333 | removal of red blood cells during splenocyte isolation |
| Mouse IFN-y (interferon gamma) ELISA kit | R&D Systems | MIF 00 | estimation of cytokine concentration in the sample |
| LNCaP prostate cancer cells | ATCC | CRL-1740 | study the effect of 3D MSCs on cancer cell lines in vitro |
| DNA-based cell proliferation assay kit | ThermoFisher | C7026 | cell number measurement based on DNA content |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5150 | component of lysis reagent |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | ThermoFisher | FERR1021 | calcium chelator, component of lysis reagent |
| Rnase A | Qiagen | 19101 | RNA degradation for measurement of DNA |
| Filter-based multi-mode microplate reader | BMG Technology | NA | Microplate assays (ELISA, cell quantification, e.t.c.) |
| HBSS (Hanks balanced salt solution), no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher/Gibco | 14175079 | resupsension of MSC spheroids prior to in vivo injections |
| Isoflurane | MWI Vet Supply | 502017 | Anesthesia for in vivo injections |
| Oxygen, compressed gas | Praxair | NA | For use with isoflurane |
| Thermo Forma BSL-2 cabinet | Thermo Fisher | Model 1385 | Sterile cell culture |
| Safety I.V. catheter/needle stiletto, 20G, 1 inch | Terumo | SR*FNP2025 | Delivery of shperoids into peritoneal cavity |
| Sterile micropipette tips | Eppendorf | varies | liquid/cells handling |
Referenzen
- Keating, A. Mesenchymal stromal cells: New directions. Cell Stem Cell. 10 (6), 709-716 (2012).
- English, K., Wood, K. J. Mesenchymal stromal cells in transplantation rejection and tolerance. Cold Spring Harb Perspect.Med. 3 (5), a015560 (2013).
- Le Blanc, K., Mougiakakos, D. Multipotent mesenchymal stromal cells and the innate immune system. Nat.Rev.Immunol. 12 (5), 383-396 (2012).
- Follin, B., Juhl, M., Cohen, S., Perdersen, A. E., Kastrup, J., Ekblond, A. Increased Paracrine Immunomodulatory Potential of Mesenchymal Stromal Cells in Three-Dimensional Culture. Tissue Eng.Part B.Rev. , (2016).
- Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells Int. , 9176357 (2016).
- Achilli, T. M., Meyer, J., Morgan, J. R. Advances in the formation, use and understanding of multi-cellular spheroids. Expert Opin.Biol. Ther. 12 (10), 1347-1360 (2012).
- Sart, S., Tsai, A. C., Li, Y., Ma, T. Three-dimensional aggregates of mesenchymal stem cells: cellular mechanisms, biological properties, and applications. Tissue Eng.Part B.Rev. 20 (5), 365-380 (2014).
- Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 107 (31), 13724-13729 (2010).
- Potapova, I. A., et al. Mesenchymal stem cells support migration, extracellular matrix invasion, proliferation, and survival of endothelial cells in vitro. Stem Cells. 25 (7), 1761-1768 (2007).
- Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Eng.Part C.Methods. 16 (4), 735-749 (2010).
- Lee, R. H., et al. Intravenous hMSCs Improve Myocardial Infarction in Mice because Cells Embolized in Lung Are Activated to Secrete the Anti-inflammatory Protein TSG-6. Cell Stem Cell. 5 (1), 54-63 (2009).
- Bartosh, T. J., Ylostalo, J. H., Bazhanov, N., Kuhlman, J., Prockop, D. J. Dynamic compaction of human mesenchymal stem/precursor cells into spheres self-activates caspase-dependent il1 signaling to enhance secretion of modulators of inflammation and immunity (PGE2, TSG6, and STC1). Stem Cells. 31 (11), 2443-2456 (2013).
- Ylostalo, J. H., Bartosh, T. J., Coble, K., Prockop, D. J. Human mesenchymal stem/stromal cells cultured as spheroids are self-activated to produce prostaglandin E2 that directs stimulated macrophages into an anti-inflammatory phenotype. Stem Cells. 30 (10), 2283-2296 (2012).
- Ylostalo, J. H., Bartosh, T. J., Tiblow, A., Prockop, D. J. Unique characteristics of human mesenchymal stromal/progenitor cells pre-activated in 3-dimensional cultures under different conditions. Cytotherapy. 16 (11), 1486-1500 (2014).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
- Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat.Rev.Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Fontaine, M. J., Shih, H., Schafer, R., Pittenger, M. F. Unraveling the Mesenchymal Stromal Cells’ Paracrine Immunomodulatory Effects. Transfus.Med.Rev. 30 (1), 37-43 (2016).
- Nemeth, K., et al. Bone marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their interleukin-10 production. Nat.Med. 15 (1), 42-49 (2009).
- Prockop, D. J. Concise review: two negative feedback loops place mesenchymal stem/stromal cells at the center of early regulators of inflammation. Stem Cells. 31 (10), 2042-2046 (2013).
- Krampera, M. Mesenchymal stromal cell ‘licensing’: a multistep process. Leukemia. 25 (9), 1408-1414 (2011).
- Saleh, F. A., Genever, P. G. Turning round: multipotent stromal cells, a three-dimensional revolution?. Cytotherapy. 13 (8), 903-912 (2011).
- Tsai, A. C., Liu, Y., Yuan, X., Ma, T. Compaction, fusion, and functional activation of three-dimensional human mesenchymal stem cell aggregate. Tissue Eng.Part A. 21 (9-10), 1705-1719 (2015).
- Yeh, H. Y., Liu, B. H., Hsu, S. H. The calcium-dependent regulation of spheroid formation and cardiomyogenic differentiation for MSCs on chitosan membranes. Biomaterials. 33 (35), 8943-8954 (2012).
- Lee, E. J., et al. Spherical bullet formation via E-cadherin promotes therapeutic potency of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood for myocardial infarction. Mol.Ther. 20 (7), 1424-1433 (2012).
