末梢血からの微小胞の単離とキャラクタリゼーション

ヒト被験者を含む全ての実験は、地元の倫理委員会（承認なし。3/2/14）によって承認されています。患者の選択のためには、年齢、性別、現在の治療レジメンと、より多くのようないくつかの要因が、血液中のMVの組成に影響を与えることができ、したがって、前のサンプル収集22,23に考慮されるべきであることに留意すべきです。 血漿サンプルの調製 EDTA（1.6ミリグラム/ mLの血液）を含有するバキュテナー採血管に21ゲージのバタフライ針を通してドナーあたりの血液の2チューブ – 1を描画します。効率的な血液抗凝固を保証するために、チューブ（複数可）を数回反転させていることを確認してください。 注： – 15 mLのその後のフローサイトメトリーおよびウエスタンブロット分析のための血液の推奨量は5です。 MVの分解及び損失を防止するために、血液試料を30分採血後<取り扱われるべきです。 で1200×gで15分間サンプルを遠心分離して血漿試料を調製室温（RT）。 残りの血液細胞（=下層）からの血漿（=上層）の分離を助けるために、バルブフィルタを適用します。 15 mLのチューブにプラズマを転送します。 1500×gで15分間遠心し、RTは、より大きな細胞破片をペレット化し、残りの血小板を除去しました。 15 mLのチューブに上清を移し、直接-20℃で6ヶ月までのためのMV分離またはストアサンプルを進めます。 注：提示プロトコルは、細胞培養上清からのMV（およびEXOS）を単離するために使用することができます。 24のための80％の密集度 – – そうするためには、60で細胞を培養小胞枯渇FCSを添加した培地で48時間、その後、上清を収集します。 750×gで5分間、4°Cの遠心分離機は、残留浮遊細胞を枯渇させる大きな細胞残屑をペレットに1,500×gで、4℃で5分間、再度新しい15 mLチューブと遠心分離機に上清を充填します。この上清を、次いでMVの単離のために使用することができます2.16 – ステップ2.1で説明したように。 MVの2の単離適切な遠心チューブに血漿サンプルを転送します。必要であれば、試料を希釈し、遠心分離手順の間に薄肉管の崩壊を防ぐためにPBSでチューブを埋めます。 14,000×gで、4℃で35分間の遠心分離。 上清をデカント、管が逆さまになって、ペーパータオル上に置いておきます。すべての残りの上清は、タオルに浸漬し、それによって試料から除去されるまで5分 – 3を待ちます。 千μLPBSでMVペレットを再懸濁し、卓上遠心機で14,000×gで、4℃で35分間、1.5 mLのチューブと遠心分離機に移します。 上清を吸引。 ペレットの大きさに応じて、500μLのPBS – 50にMVペレットを再懸濁します。あるいは、溶解のMV直接、 例えば 、RIPA緩衝液（150mMのNaCl / 0.1％SDS / 0.5％デオキシコール酸Na / 1％トリトンX-100 / 50mMのトリス、pH7.2）でその後のウェスタンブロット分析のために。 -20℃で保存するのMV。彼らは、数ヶ月間安定したままですが、繰り返し凍結融解サイクルを回避することができます。 オプション：次の実験のためのMVの収量や用量のMVを評価するために、タンパク質アッセイ（ 例えば 、ブラッドフォードやローリー法）とMVのタンパク質濃度を決定します。 追加EXOSは、血漿サンプルから単離する場合は、11万XG、4°Cで2時間超遠心チューブと遠心分離機にステップ2.3から上清をデカント。ステップ2.3で説明したように上清を除去、千μLのPBSにエキソペレットを再懸濁し、小（1.5 mL）を超遠心チューブに移します。 75μLPBSまたはRIPA緩衝液 – 11万×gで、4°C、上清を吸引し、50でエキソペレットを再懸濁で2時間超遠心機。 フローサイトメトリーによるMVの3キャラクタリゼーション転送15μLのPBS + 1％の小胞枯渇ウシ胎児血清（FフローサイトメトリーチューブでCS）。 注：ベシクル枯渇FCSを11万×gで18時間熱不活化（56℃、30分）FCS遠心分離し、先に説明したように24、0.2μmのフィルターを通して上清を濾過することによって調製されます。 PBS中のMVの5μgの（3μgのも適用可能であり、低利回りの場合）を追加します。 MV表面に非特異的結合部位をブロックし、それによりバックグラウンド染色を減少させるために室温で30分間、サンプルをインキュベートします。 タンパク質の関心に対する蛍光標識抗体を追加します。最適濃度を決定し、低い信号対雑音比を保証するために使用する前に、染色のために使用される抗体の量を滴定します。また、陰性対照として未染色のMVと1チューブと（1μgの抗体が使用される場合、例えば 、また、アイソタイプコントロールAN1μgのを使用するのと同じ濃度で一致するアイソタイプ対照抗体で染色したMVの1チューブを含むようにしてくださいバックグラウンド染色を定量するtibody）。 注：これは、異なる蛍光色素に結合された複数の抗体を添加することにより、多色フローサイトメトリーを行うことも可能です。 暗所でRTで20分間インキュベートします。 250μLのPBSを加え、フローサイトメーターを用いて、試料の測定を進めます。 ケースではサンプルがすぐに測定することができないことを、4°Cでのサンプルや店舗を修正するために150μLのPBSおよび50μLの4％パラホルムアルデヒド（PFA）を追加します。注意：PFAは有毒です。手袋、適切な個人用保護具を使用します。 可能な限り低い値にフローサイトメーターのしきい値を減らして、対数スケールで側方散乱（SSC）プロット対前方散乱（FSC）を使用して、MVの人口を検索します。 MV集団に対するゲートとは、対応するヒストグラムの蛍光シグナルを評価します。 ウェスタンブロッティングによるMVの4キャラクタリゼーション直接MVペレットを再懸濁適切な溶解バッファー（ 例えば 、RIPAバッファー）。 適切な溶解緩衝液（ 例えば 、RIPA緩衝液）中で1：MVペレットを既にPBS中に再懸濁された場合に、それを少なくとも1希釈します。 ローリーアッセイによって、例えば 、MVのサンプルのタンパク質濃度を決定します。 22.5μLRIPA緩衝液中のMVの20μgの – 10を準備します。次いで、95℃で5分間、7.5μL4倍のLaemmliローディング緩衝液と熱を加えます。 ポリアクリルアミドゲル上の負荷サンプルとは、標準的なプロトコルに従って電気泳動およびイムノブロッティングを行います。 メンブレンにタンパク質を転写した後、標準的なプロトコルに従ってローディングコントロールとしてポンソー染色を行います。 室温で5分間TBST中で脱色膜。 TBST中の5％BSA中、室温で1時間に30分までのブロック膜。 一晩または室温で2時間4℃で一次抗体と共に膜をインキュベートします。 TBST 3×5分で膜を洗浄します。 5％BSA 10,000：1の希釈でHRP結合二次抗体で膜をインキュベートします。注：高いバックグラウンド信号の場合には、代わりにBSAの粉乳を使用します。 TBST 3×5分で膜を洗浄します。 ECL検出試薬を有する膜を開発し、化学発光フィルムまたは化学発光画像化システムの信号を検出します。 注：EXOSからのMVを識別するために、チューブリンのようなタンパク質は、使用することができる4アクチニン又はmitofilin主のMV 16,25上に存在する必要があります。 EXOSのためのマーカーとして使用される最もテトラスパニン抗体（ 例えば、CD9、CD81）は、還元条件下で動作しないため、70℃で10分間加熱することにより、非還元ローディング緩衝液中で調製されるべき注意を払ってください。